人卵巢癌肿瘤干细胞样细胞的分离、鉴定及对化疗药物敏感性的研究

摘要

卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。高复发率和复发后的高耐药率是其高死亡率最主要的原因之一。近年来提出的肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)学说认为肿瘤组织由异质性的细胞群体构成；肿瘤组织中存在极少量具有干细胞性质的癌细胞亚群，具有多向分化潜能和无限的增殖及自我更新能力，是肿瘤发生、发展、侵袭、转移、复发、及耐药的决定性因素。CSCs目前已在血液系统肿瘤及乳腺癌、脑肿瘤等实体瘤中相继分离。卵巢癌CSCs的研究相对较迟，其表型还不明确，存在较多争议，耐药等特点的研究尚有待完善。
　　 本研究首先以人上皮性卵巢癌细胞系3AO为模型，进行卵巢癌肿瘤干细胞样细胞（Cancer stem cell-like cells，CSC-LCs)的分离、鉴定，明确其细胞标志物；并观察不同浓度下CSC-LCs对化疗药物敏感性的变化。在此研究基础上，对卵巢癌原代标本CSC-LCs进行了初步研究。旨在从CSCs视角，阐明卵巢癌发生和耐药机制，为探索卵巢癌诊治新靶点提供实验证据。
　　 第一部分：3AO细胞系中卵巢癌CSC-LCs的分离和鉴定
　　 目的：
　　 从人上皮性卵巢细胞系3AO中分离鉴定CSC-LCs，明确其细胞标记物，并对其进行药物敏感性研究。
　　 方法：
　　 无血清悬浮培养法形成3AO肿瘤细胞球体，流式检测明确其表型，并使用该表型进行流式分选，将收获的细胞进行异种移植成瘤、干细胞标志物检测及分化等鉴定实验，并观察不同浓度下CSC-LCs对泰素和卡铂敏感性的变化。
　　 结果：
　　 1.3AO细胞亚群可形成能自我更新的悬浮球体；
　　 2.3AO球体细胞富集CD44?CD24?表型细胞；
　　 3.3AO球体细胞及CD44?CD24?细胞具有高度致瘤性；
　　 4.CD44?CD24?细胞可分化为CD44?CD24?细胞；
　　 5.CD44?CD24?细胞对泰素和卡铂高度耐药。
　　 结论：
　　 1.CD44?CD24?卵巢癌细胞具有CSC-LCs新的表型特征、自我更新能力及高致瘤能力，且可分化为CD44?CD24?卵巢癌细胞，证实其为卵巢癌CSC-LCs。
　　 2.CD44?CD24?卵巢癌细胞对化疗药物具有显著耐药性，卵巢癌的治疗应该靶向CD44?CD24?卵巢癌细胞。
　　 第二部分：卵巢癌组织和腹水细胞原代标本中CSC-LCs的初步研究
　　 目的：
　　 证实卵巢癌标本原代培养细胞中卵巢癌CSC-LCs的存在。
　　 方法：
　　 取新鲜晚期卵巢上皮性癌组织和腹水，经切割、消化、分离等处理后，将获得的单细胞悬液在无血清条件下悬浮培养形成肿瘤细胞球体。收集该原代卵巢癌球体细胞，流式检测明确其表型特点并观察体外分化情况，免疫荧光验证干细胞标志物表达。将卵巢癌球体细胞与其分化细胞比较，观察其对泰素或卡铂的药物敏感性差异.
　　 结果：
　　 1.卵巢癌组织和腹水细胞体外可形成球体细胞；
　　 2.原代卵巢癌球体细胞中富集CD44?CD24?表型；
　　 3.原代卵巢癌球体细胞表达干细胞标志物；
　　 4.原代卵巢癌CD44?CD24?球体细胞可出现分化；
　　 5.原代卵巢癌CD44?CD24?球体细胞对泰素和卡铂高度耐药。
　　 结论：
　　 上皮性卵巢癌原代细胞经球体细胞培养，富集CD44?CD24?表型，并表达干细胞表型，具有分化能力及显著的化疗药物耐药性，提示来自原代的CD44?CD24?卵巢癌细胞为卵巢癌CSC-LCs。