油菜EMS诱变群体的构建以及油脂代谢相关基因等位多态性与油脂品质关系的研究

摘要

油菜是世界上重要的油料作物，含油量的提高和脂肪酸品质改良是当今油菜育种重要的目标。分子标记辅助选择育种(MMAPB)是提高作物农艺性状和种子品质性状的有效手段，现有的各种DNA分子标记的开发应用以及丰富的基因组和ESTs序列数据信息为遗传研究和分子标记辅助育种提供了极大的便利。人们对于模式植物拟南芥油脂合成相关基因功能的深入理解对于油菜品质育种具有极大的参考价值。
　　 然而据我们所知，目前几乎还没有关于油菜的油脂代谢相关基因位点的等位变异与种子脂肪酸成分积累的关系的研究报道。本文旨在研究那些偏向于在种子中表达，并且影响脂肪酸组分的关键基因位点在EMS诱导的M2群体中，以及54个地方栽培品种资源中的等位多态性，及其这些等位变异与种子品质，特别是不饱和脂肪酸含量之间的关系。研究的结果如下：
　　 1.利用甲基磺酸乙酯(EMS)溶液处理甘蓝型油菜双低品种“浙双72”种子，经田间M1代观察和M2代筛选及部分M3代验证，最终筛选到叶色、叶形、株高、茎色，花色、花瓣、雄性不育及开花期等性状发生明显变异的M2突变株；对M3种子的主要脂肪酸组分之间，以及脂肪酸组分与种子含油量进行了相关与回归分析，同时描述了各种脂肪酸组分和含油量的变异幅度与分布，提取了2558份包含突变性状的M2植株叶片的DNA。
　　 2.对基因FAD2、FAD6、FAD7和FAD8在甘蓝型油菜幼嫩种子和叶片中的转录水平差异作了分析，发现FAD2和FAD6在叶片和种子中转录水平无明显差异，而FAD7和FAD8基因更偏向于在叶片中转录。同时对6个FAD基因的12条BAC克隆序列和GeneBank的EST序列运用DNAStar5.0的MegAlign程序进行序列比对，结果以聚类分枝树的形式呈现，结果显示FAD3、FAD7和FAD8的序列相似度较高，FAD2的序列与FAD5和FAD6的序列处与不同的分枝，三者相似度较低。
　　 3.利用HRM技术分析FAD2基因的SNP变异，最终在比对区域统计出12个导致氨基酸序列变化的M2样品。在这12个样品中，只有3个样品种子的油酸含量相对CK有显著提高，有6个油酸含量显著降低，有3个油酸含量与对照差异不明显。3个样品(代号529-3，1841-2和1823-4)种子油酸含量的升高可能与比对区域DNA序列的变异导致的FAD2酶蛋白氨基酸的突变有关。
　　 4.从拟南芥600多个与油脂合成和代谢相关基因位点中选出75个倾向于在种子中表达的基因来研究所选油菜地方种质资源的基因等位多态性，一共在上述75个基因上设计了150对引物，平均每个基因包含两对引物。在Tapitor和宁油7号两个油菜品种间进行筛选标记发现52对引物具有多态性，这些具有多态性的引物被当作ILP标记，在上述52个标记中挑出34个多态性较好的标记，这些标记被用来检测包含54个油菜地方栽培品种的油脂代谢基因的内含子的多态性。平均每对引物在覆盖的区域扩增出5.6个等位位点，分析油脂代谢相关基因的等位多态性与种子含油量和脂肪酸含量存在的相关性发现标记FAD7-ics11170(3/4)与种子中亚麻酸的积累相关，等位多态型FAD7-ics11170(3/4)-c与高亚麻酸含量相关，说明这个标记可以作为筛选高亚麻酸育种材料的有效手段。
　　 综上所述，本项研究描述了EMS诱导的M2群体和部分油菜地方品种中调控脂肪酸组成的基因位点的等位变异，以及这些等位变异与种子品质性状的关系。这些研究结论丰富了人们对于油菜种子油脂代谢分子机制的理解，并且为高不饱和脂肪酸含量分子标记辅助育种奠定了良好的基础。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

缩略术语词表

图表一览

LIST OF TABLES AND FIGURES

第一章 文献综述

引言

1.1 植物脂肪酸组成调控的研究进展

1.1.1 植物脂肪酸脱饱和的基本途径

1.1.2 与植物脂肪酸脱饱和相关的酶及基因

1.2 油菜脂肪酸品质改良的研究进展

1.2.1 单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸概述

1.2.2 脂肪酸相关性研究

1.2.3 油菜脂肪酸品质改良目标

1.2.4 油菜脂肪酸品质改良途径

1.3 油菜高含油量育种的研究进展

1.3.1 高含油量育种的可行性与含油量的遗传模式

1.3.2 高含油量育种的途径

1.4 基因表达研究方法的发展

1.4.1 基因表达研究方式的发展

1.4.2 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR技术)

1.4.3 油脂相关基因表达调控的研究

1.5 油菜油脂相关基因位点分子标记的开发和应用

1.5.1 分子标记的发展

1.5.2 基于PCR扩增的分子标记

1.5.3 单核苷酸多态性SNP标记

1.5.4 HRM技术

1.6 本项研究的目的意义

第二章 甘蓝型油菜EMS诱变后代形态与品质性状的变异

前言

2.1 材料与方法

2.1.1 供试材料

2.1.2“浙双72”种子的EMS处理

2.1.3 M1和M2代植株田间性状的统计

2.1.4 M2植株和对照DNA的提取

2.2 结果与分析

2.2.1 M1和M2群体农艺性状的观察和统计

2.2.2 M3种子品质性状分析

2.3 讨论

2.3.1 诱变育种在油菜遗传改良方面的意义

2.3.2 不饱和脂肪酸和含油量在M3种子中的分布

2.3.3 不饱和脂肪酸之间及与含油量的相关性

2.3.4 油菜诱变育种目标

第三章 M2代诱变群体油脂相关基因等位多态性以及FAD2位点的SNP分析

前言

3.1 材料和方法

3.1.1 试验材料的分组与种植

3.1.2 方法

3.2 结果与分析

3.2.1 总RNA的提取和cDNA的合成

3.2.2 各FAD基因的RT-PCR分析结果

3.2.3 各FAD基因的序列比对结果

3.2.4 油脂代谢相关基因等位多态性分析

3.2.5 HRM差异分析

3.2.6 序列比对

3.3 讨论

3.3.1 FAD基因在油菜叶片和种子中的表达

3.3.2 FAD酶的功能和分类

3.3.3 HRM技术的优点和不足

3.3.4 EMS诱导的SNP变异的规律探讨

3.3.5 FAD2基因碱基突变对种子油酸含量的影响

第四章 芸薹属油料作物种质资源油脂代谢相关基因位点等位多态性分析

前言

4.1 材料和方法

4.1.1 试材的种植

4.1.2 DNA提取和种子脂肪酸及含油量测定

4.1.3 ILP标记的开发与内含子多态性检测

4.2 结果与分析

4.2.1 毛细管电泳图的多态性类型

4.2.2 油脂代谢相关基因等位位点的鉴定

4.2.354个油菜地方品种中基因等位多态型的统计

4.2.4 基因等位多态性与种子油脂品质的相关性

4.3 讨论

第五章 结果与展望

5.1 结果

5.1.1 油菜EMS突变体库的构建

5.1.2 FAD基因的转录差异和FAD2基因的SNP突变对种子油酸含量的影响

5.1.3 ILP标记高不饱和脂肪酸含量

5.2 展望

参考文献

附录、研究成果、致谢