人脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白的表达及降糖作用测定

摘要

前言:
　　 脂联素(Adiponectin)是脂肪细胞分泌的特异性蛋白,具有增加胰岛素敏感性、降糖、降脂、抗炎、拮抗动脉粥样硬化等作用。C-端球状域(即脂联素球状域,Globular Adiponectin,gAdiponectin,gAd)为其功能域,作用强于全长脂联素。胰升糖素样肽-1(Glucagons-like Peptide-1,GLP-1)是胰岛α细胞和肠粘膜L细胞分泌的一种激素,GLP-1的活性域位于N-端,它可以促进胰岛素的释放,其作用是依赖葡萄糖的。它还具有促进β细胞增生,抑制胰高糖素的分泌,增加肝糖原及肌糖原的合成,降低食欲,抑制胃排空等作用。可GLP-1的体内半衰期很短,在体内GLP-1主要以两种形式进行清除:酶清除与器官清除。
　　 前期研究中应用基因重组技术用一简单的长接头序列基因将gAd的N-端与GLP-1的C-端基因相连,同时,将GLP-1的第8位氨基酸丙氨酸密码子GCT突变为甘氨酸密码子GGT(表达产物为胰升糖素样肽-1类似肽即Glucagons-likePeptide-1-A,GLP-1-A),其N-端引入6个组氨酸标签基因序列(6×His tag基因序列)以及肠激酶识别基因序列,获得了含有脂联素球状域.胰升糖素样肽-1类似肽融合基因的PET28a-脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽重组质粒(PET28a-gad-GLP-1-A),表达出一种新的融合蛋白即含6个组氨酸标签序列的脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白(6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白)。本研究拟在前期研究的基础上进一步研究gAd-GLP-1-A融合蛋白的获得及其降糖作用测定。6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白被表达,纯化,复性,肠激酶切割。最后用动物实验研究证实了gAd-GLP-1-A融合蛋白具有降糖作用。
　　 材料与方法:
　　 第一:6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白的表达
　　 将测序正确的PET28a-gAd-GLP-1-A质粒转化入感受态表达细菌BL21(DE3)。IPTG诱导融合蛋白蛋白的表达,超声破碎分离上清与沉淀(融合蛋白主要存在于包涵体中,包涵体存在于沉淀中),用12％SDS-PAGE和Western Blot鉴定融合蛋白。
　　 第二:gAd-GLP-1-A融合蛋白的获得
　　 将包涵体蛋白洗涤,溶解,而后用Ni-IDA树脂纯化,测定蛋白浓度,于尿素溶液中梯度复性,再进行蛋白浓缩,肠激酶切割,得到gAd-GLP-1-A融合蛋白,用12％SDS.聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western Blot鉴定。
　　 第三:糖尿病鼠模型的建立以及gAd-GLP-1-A融合蛋白的降糖作用测定
　　 腹腔注射链脲佐菌素构建糖尿病小鼠模型。雄性昆明小鼠24只,分为正常对照组,糖尿病对照组和糖尿病治疗组,糖尿病治疗组腹腔注射gAd-GLP-1-A融合蛋白,正常对照组及糖尿病对照组腹腔注射等量的生理盐水,分别在30min,1h,1.5h,2h,2.5h,3h测定血糖,观察血糖变化。
　　 结果:
　　 第一:行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,诱导后菌液与诱导前菌液相比,于25KD左右有较浓的蛋白条带,与预期的6×Histag-gAd-GLP-1-A融合蛋白大小一致,且诱导后菌液沉淀中蛋白条带最粗。用抗His tag单克隆抗体做Western Blot鉴定显示上清及沉淀中均有6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白表达,且该蛋白主要存在于包涵体中。
　　 第二:对包涵体蛋白和包涵体纯化蛋白进行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot分析,显示6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白得到纯化。
　　 第三:对肠激酶酶切后的蛋白进行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot分析,显示肠激酶成功将6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白中的His tag去除,得到了gAd-GLP-1-A融合蛋白。
　　 第四:降糖作用测定中,糖尿病治疗组小鼠腹腔注射gAd-GLP-1-A融合蛋白,正常对照组及糖尿病对照组小鼠腹腔注射等量的生理盐水,结果发现在2h,2.5h,3h时糖尿病治疗组血糖显著低于糖尿病对照组。
　　 结论:
　　 第一:大部分6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白存在于包涵体中。
　　 第二:纯化并复性了包涵体融合蛋白。
　　 第三:肠激酶切割6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白,成功将His tag去除,得到gAd-GLP-1-A融合蛋白。
　　 第四:小鼠实验证实了gAd-GLP-1-A融合蛋白具有降糖作用。

目录

文摘

英文文摘

致谢

论文说明:缩略词表

1 前言

2 实验材料、方法以及结果

3 讨论

4 结论

参考文献

综述 脂联素与胰升糖素样肽-1的研究进展

作者简历及在学期间所取得的科研成果