稳定表达人有机阴离子转运多肽OATP1B1野生型及其突变体的HEK-293细胞系的构建

摘要

药物的体内过程包括吸收、分布、代谢和排泄四个过程。其中吸收、分布和排泄都涉及到药物的转运(Drug transport)。近年来,随着分子生物技术的发展和应用,生物膜上的各种外排和摄取转运体(Transporter)在介导药物跨膜主动转运和肝脏清除的过程中所起到的关键作用已经得到了广泛关注和研究。药物从血液进入肝细胞,窦状小管膜是进入的通道。药物除了以被动扩散方式透过窦状小管膜外,还能借助于各种位于窦状小管膜上的转运体主动吸收。许多药物都在肝内能浓集,这与肝细胞的主动摄取有关。有机阴离子转运多肽OATP1B1(又称OATP-C),是一种特异性分布于肝细胞基底膜上的一种转运蛋白,与体内诸多内源性或外源性物质的肝脏摄取作用关系密切。例如胆汁酸、硫化和葡萄糖醛酸化结合物、甲状腺素、多肽、甲氨蝶呤和他汀类药物都是OATP1B1的底物。可以说OATP1B1是许多内源性化合物和药物从血液进入肝脏的重要转运体”。OATP1B1与药物的相互作用方式可能对药物的药物动力学和药效学产生重要影响。另外,近年来OATP1B1基因上已发现多个单核苷酸多态性(SNP),其中有些SNP已经在体内或体外实验中被证实与转运体功能异常有关。例如,OATP1B1521T＞C基因突变在东方人的发生频率约为15.8％,它可导致他汀类降脂药普伐他汀的非肾清除率降低,血药浓度增高。鉴于OATP1B1在介导生理功能和药理效应中的重要作用,对多态性的研究将有助于为手性药物反应个体差异提供分子水平的解释,同时也为临床合理用药提供指导。目的构建稳定表达人有机阴离子转运多肽OATP1B1野生型及其突变体的人胚肾上皮HEK-293田胞转基因细胞系,同时建立适用于体外细胞模型的OATP1B1手性底物盐酸非索非那定柱前手性衍生化分析方法以及手性底物氟伐他汀的手性拆分方法,为后期研究OATP1B1野生型及其突变体对手性药物对映体转运的的立体选择性特征,对映体-对映体在转运时的相互作用提供分析手段。方法提人肝总RNA,逆转录获得cDNA,并以此为模板进行PCR扩增得到人OATP1B1*1a基因。胶回收目的片段后连接至PMD19-T载体上并进行DNA测序,选择正确的DNA序列,同时通过点突变方法得到OATP1B1*1b/*15突变体基因,与pcDNA3.1(+)质粒连接得至刂pcDN A3.1(+)/OATP1B1野生型及突变体质粒,通过LipofectamineTM2000专染试剂转染人胚肾上皮细胞HEK293,经G418筛选获得抗性克隆。通过OATP1B1的典型底物瑞舒伐他汀在各单克隆细胞内的积聚量检测OATP1B1的活性。反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹Western blot)检测人OATP1B1的mRNA和蛋白表达量,从而筛选出稳定表达HEK293-OATP1B1野生型及突变体的单克隆细胞株。此外,选用R(+)-苯乙基异氰酸酯作为手性衍生化试剂,与非索非那定生成氨基甲酸酯衍生物,通过反相高效液相串联质谱(LC-MS)实现分离分析;采用正相手相固定相高效液相色谱法,建立了氟伐他汀对映异构体的分离分析方法。结果对构建OATP1B1野生型及突变体的每个步骤进行鉴定,结果表明本实验成功构建了含有正确基因序列的重组pcDNA3.1(+)/OATP1B1OATP1B1野生型及突变体真核表达质粒,通过LipofectamineTM2000专染试剂转染人胚肾上皮细胞HEK293,通过RT-PCR实验验证了目的基因在mRNA水平上的表达;利用western blot实验验证了目的蛋白在蛋白质水平的表达。最后以瑞舒伐他汀为底物,对重组转运体的摄取活性进行了检测。结果表明已成功构建了稳定表达人OATP1B1野生型及突变体的HEK293细胞系。

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摘要

ABSTRACT

1 引言

1.1 肝胆外排与药物转运体

1.2 有机阴离子转运多肽OATP1B1

1.3 SLCO1B1基因多态性

2 人OATP1B1~*1a/~*1b/~*15基因的构建

2.1 实验仪器与材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

3 稳定表达人OATP1B1~*1a/~*1b/~*15的HEK-293细胞系的构建

3.1 实验仪器与材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

4 手性底物非索非那定柱前衍生化手性分析方法的建立

4.1 实验仪器与材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

5 手性底物氟伐他汀对映体分析方法的建立

5.1 实验仪器与材料

5.2 实验方法

5.3 实验结果

5.4 讨论

参考文献

综述

参考文献

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