HIV-1p24TaqMan荧光定量检测系统和HIV-1体外复制、检测系统的建立及评价

摘要

艾滋病已对全人类的健康造成了严重的威胁。这促使科研工作者奋不顾身投入到艾滋病诊治的研究中,并且他们取得了丰硕的成果,但这仍不能有效控制艾滋病在全球的蔓延,因此我们仍需再接再厉开发更好的诊治技术以遏制艾滋病疫情的发展。
　　 艾滋病的诊断技术主要包括:HIV-1 RNA载量检测、抗体检测、HIV-1蛋白抗原检测等技术,它们在艾滋病诊断中起着重要作用。而其中HIV-1 RNA载量检测技术最灵敏[1],它在HIV-1窗口期、垂直传播的早期诊断[2]、HARRT治疗病人的病毒复制监测[3]等领域中均可发挥重要作用。然而,经FDA批准的HIV-1 RNA定量检测试剂盒价格昂贵,包括:Roche Amplicor HIV-1 Monitor Test.,version1.5,bioMérieux NucliSens HIV-1 QT Assay,and Versant HIV-1 RNA3.0 Assay(bDNA)[4-10]。国内的HIV-1 RNA定量试剂盒也存在价格偏高的问题。该因素限制了这类试剂盒在我国资源有限地区的应用。此外,国内尚无检测HIV-1 RNA p24载量的TaqMan荧光定量PCR的文献报道,因此有必要建立实验室内HIV-1 p24 TaqMan荧光定量PCR检测系统,以此降低艾滋病病毒检测成本、促进的临床诊断工作。
　　 在艾滋病治疗方面:虽有长足进步,但仍无根治性的治疗方法,亟需创建高通量的、简便易行的HIV-1体外复制和检测系统以用于抗HIV-1有效药物的筛选,从而加快抗HIV-1药物的研发。
　　 本研究分两部分进行:
　　 第一部分:HIV-1荧光定量检测系统的建立及评价
　　 第二部分:HIV-1体外复制、检测系统的建立及评价
　　 第一部分:HIV-1 p24 TaqMan荧光定量检测系统的建立及评价
　　 目的:
　　 建立检测HIV-1-p24拷贝的TaqMan实时荧光定量聚合酶链式反应系统(HIV-1p24 TaqMan FQ-PCR),并初步探索应用于实验室标本和临床样本检测。
　　 方法:
　　 通过对H9细胞进行RNA抽提、逆转录、PCR及载体构建的方式得到重组质粒pEGFP-N1-p24。采用脂质体转染法转染质粒pEGFP-N1-p24于293T细胞、G418筛选、有限稀释法使其稳定表达,从而得到稳定表达p24的阳性对照细胞株。应用逆转录、ELISA、荧光显微镜观察等方法鉴定该pEGFP-N1-p24-293T细胞株中p24的表达。以pEGFP-N1-p24模板PCR扩增p24及建立标准曲线以及HIV-1 p24 TaqManFQ-PCR系统。用HIV-1 p24 TaqMan FQ-PCR系统、国内同类某检测试剂盒与HIV-1-ELISA试剂盒(Bio-Rad)检测50份HIV阳性病人外周静脉血、30份健康人外周静脉血、50份HBV阳性外周静脉血及50份HCV阳性外周静脉血、H9细胞株,pEGFP-N1-p24293T细胞株。其中每个标本用HIV-1 p24 TaqMan FQ-PCR系统重复检测三次,并设复孔。通过与其它试剂盒同时检测实验室及临床样本HIV-1 p24载量来验证该检测系统的可靠性、灵敏性、特异性、稳定性等特点。
　　 结果:
　　 (1)HIV-1-ELISA试剂盒(Bio-Rad)检测50份HIV-1阳性病人外周静脉血、H9细胞株(5.0×105个/ml,0.5ml),pEGFP-N1-p24293T细胞株(5.0×105个/ml,0.5ml)均为阳性;30份健康人外周静脉血、50份HBV阳性外周静脉血及50份HCv阳性外周静脉血均为HIV-1阴性。
　　 (2)用HIV-1 p24 TaqMan FQ-PCR系统与国内同类某HIV-1荧光定量检测试剂盒检测50份HIV-1阳性病人外周静脉血、30份健康人外周静脉血、50份HBV阳性外周静脉血及50份HCV阳性外周静脉血,HIV-1真阳性率为100％,假阳性率0％。说明该检测系统具有灵敏性、特异性的特点。
　　 (3)HIV-1 p24 TaqMan FQ-PCR系统与国内同类某HIV-1荧光定量检测试剂盒检测50份HIV-1阳性病人外周静脉血检测的样本平均值无统计学差异(t=0.346,P=0.730＞0.05),两组检测值呈线性相关(相关系数r达0.986,P＜0.01)。说明该检测系统检测结果可靠。
　　 (4)HIV-1 p24 YaqMan FQ-PCR系统单独检测复孔间以及独立3次对同一标本检测结果之间变异系数均小于5.09％说明该检测系统具有稳定的特点。
　　 结论:
　　 该HIV-1 p24 TaqMan FQ-PCR技术可靠、灵敏、特异、稳定、经济,并可初步用于实验室标本和临床样本检测。
　　 第二部分:HIV-1体外复制、检测系统的建立及评价目的:
　　 建立HIV-1体外复制和检测系统(JLTRG/H9细胞混合培养体系)并初步应用于抗HIV-1有效药物筛选。
　　 方法:
　　 JLTRG细胞与H9细胞按不同比例混合培养后,通过荧光显微镜、流式细胞技术分别于24、48、72、96小时观察和检测JLTRG细胞EGFP的表达来评估JLTRG细胞感染程度,并以此确定最优感染体系。然后以此最优体系来筛选抗HIV-1有效药物。
　　 结果:
　　 (1)在JLTRG/H9细胞混合培养体系中,JLTRG与H9细胞混合培养比例为10:1时,JLTRG细胞EGFP表达量在各个时间点均为最高,提示此细胞浓度比例下,JLTRG细胞的感染效率最高。
　　 (2)在JLTRG/H9细胞混合培养体系(JLTRG与H9细胞数比值10:1)中,T-20能有效抑制JLTRG细胞EGFP的表达,并且呈现剂量依赖性。该结果提示:在该体系中T-20能有效抑制HIV-1感染JLTRG细胞。
　　 结论:JLTRG/H9细胞混合培养体系(JLTRG与H9细胞数比值10:1)适用于HIV-1药物筛选。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

致谢

引言

第一部分 HIV-1 p24 TaqMan实时荧光定量检测系统的建立及评价

1.1 试验材料、试剂、仪器

1.2 实验方法

1.3 结果

1.4 讨论

第二部分 HIV-1体外复制、检测系统的建立及评价

2.1 试验材料、试剂、仪器

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4 讨论

全文总结

参考文献

综述:HIV-1 Nef下调MHC-Ⅰ分子研究进展

作者简历及在学期间所取得的科研成果