融合多肽靶向DNA蛋白激酶自主磷酸化的放射增敏实验研究

摘要

由辐射引起的DNA损伤的主要类型包括碱基损伤、单链断裂(single strandbreaks,SSBs)和双链断裂(DSBs)。真核细胞有非常复杂的酶修复系统来消除这些暴露于辐射引起的损伤,碱基损伤和SSBs不被认为是致命的损伤,因为即使它们产生的频率比DNA双链断裂高,它们会完全和迅速地被修复。因为DNA双链断裂修复相当缓慢,并可能在不正确的错误连接对导致染色体畸变,所以DSBs属于电离辐射的致死性效应。碱基损害和SSBs通过碱基切除修复(base excisionrepair,BER)的途径完成修复。DSBs的修复是由两个不同的修复机制完成:被称为非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HRR)。NHEJ通路通常被认为是控制辐射对肿瘤细胞诱发致死性损伤得主要途径。虽然NHEJ涉及多个蛋白质的参与,但DNA蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)是一个关键酶。当DNA双链断裂时,DNA-PKcs通过磷酸化被激活,并和它的调节亚基KU70和KU80一起稳定地附着在DNA的断裂末端。这个蛋白质复合物和其他蛋白质,如Mre11、Rad50、Nbs1、XRCC4、和DNA连接酶Ⅳ在一起完成DNA的断裂两端的再连接。共济失调毛细血管扩张症突变(ATM)是另一个重要的修复蛋白,DNA损伤时,参与对细胞周期检测点的调控。
　　 DNA损伤修复机制决定细胞对放射线的内在的放射敏感性。大多数恶性肿瘤对射线不敏感,因而导致照射后复发。如果能够抑制DNA损伤后的修复,则有可能使肿瘤细胞对放射敏感。近年来众多的研究都针对这一方向。Non-homologousDNA end joining(NHEJ)是一种主要DNA损伤修复机制,NHEJ需要至少六种蛋白:Ku70／Ku80异聚体、DNA-PKcs、XRCC4、DNA连接酶Ⅳ和Artemis。DNA-PKcs作为主要的酶影响DNA修复的过程,因而其可以作为一种理想的分子靶。DNA—PKcs在ABCDE(T2609、S2612、T2620、S2624、T2638及T2647),PQR(S2023、S2029、S2041、S2051,S2053、S2056)等区域进行自主磷酸化。研究证明了突变以上位点造成DNAPKcs自我磷酸化障碍可以影响DNAPKcs的活性而增加放射敏感性。本课题研究中,我们设计用大分子化合物融合多肽来干扰DNA-PKcs的磷酸化,从而影响DNAPKcs的活性。融合多肽由两个功能区组成:一部分为肿瘤靶向区即入细胞区(引导肽):HIV1-TAT部分的氨基酸序列,即TAT蛋白转导域(氨基酸序列为:YGRKKRRQRRR),具有很强的穿过细胞膜和核膜的功能。另一部分为分子靶向区,选择DNA-PKcs的ABCDE结构域部分,分3个肽序列:FVET(2609)QAS(2612)QGT,QTRT(2620)QEGS(2624)LS,T(2638)QQQHDFTLT(2647)。分别与HIV1-TAT融合。
　　 我们设想:融合多肽能够穿过细胞膜和核膜；融合多肽能够增加肿瘤细胞的放射敏感性；其中融合多肽的放射增敏作用机制很可能是:通过抑制相应位点丝(S)、苏(T)氨酸的自主磷酸化(Autophosphorylation)并进一步抑制其下游的Artemis磷酸化而产生作用。
　　 1融合多肽的设计、合成及序列和纯度的验证
　　 我们将蛋白转导功能域称为肿瘤细胞靶向区,序列选择HIV1-TAT的一部分,氨基酸序列为:YGRKKRRQRRR,分子量为1560。分子靶向区选择DNA-PKcs的ABCDE结构域部分,分3个肽序列:FVET(2609)QAS(2612)QGT,QTRT(2620)QEGS(2624)LS,T(2638)QQQHDFTLT(2647)。分别与HIV1-TAT融合,这样便于分别研究三个多肽的放射增敏作用及相应的作用机制。同时设计随机肽序列(scrambled sequence)作为阴性对照。Biotin标记在多肽的N-端(N-terminusof the peptides)便于观察多肽的入胞情况(多肽具体序列及相对应英文缩写见图1.1)。
　　 Biotin-TAT(BT)用于观察细胞穿膜肽TAT自身的穿胞作用,Biotin-wtDIP1(Bw1)仅为Biotin标记的分子靶向区多肽(FvET(2609)QAS(2612)QGT),未与HIV1-TAT连接,用于观察在没有细胞穿膜肽TAT引导的情况下分子靶向区多肽是否有穿膜作用。Biotin-TAT-scDIP1(BTs1)和Biotin—TAT-scDIP2(BTs2)为与细胞穿膜肽TAT连接的两个随机肽。Biotin-TAT-wtDIP1(BTw1)、Biotin-TAT-wtDIP2(BTw2)和Biotin-TAT-wtDIP3(BTw3)分别是HW1-TAT与FVET(2609)QAS(2612)QGT、QTRT(2620)QEGS(2624)LS和T(2638)QQQHDFTLT(2647)3个分子靶向区多肽融合后的多肽。
　　 多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程,固相合成顺序一般从C端向N端合成。为了防止副反应的发生,参加反应的氨基酸的侧链都是被保护的；而羧基是游离的,并且在反应之前必须活化。化学合成方法有两种,即Fmoc和tBoc。
　　 所有合成的多肽得到产品后,经ESL-MS检测所有合成多肽的实际分子量均与各自对应的目标分子量接近,说明该多肽实际分子量与理论值相符,分子量正确(具体见图1.3A-图1.9A),序列正确。HPLC检测分析得各样品纯度均大于95％(具体见图1.3B-图1.9B)。
　　 2融合多肽入胞、细胞动力学和细胞毒作用的实验研究
　　 我们首先观察和检测融合多肽在多个细胞系中的入胞效果,所用的细胞系包括:人肠癌细胞系RKO、SW480和人宫颈癌细胞系Hela。10μM多肽加入培养的细胞中60分钟后,用免疫荧光显微镜评估肽的定位。应用共聚焦显微镜观察多肽在细胞中的滞留时间。观察融合多肽的半衰期(half-life)。用MTT(3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)检测和评价评价多肽的细胞毒作用。用DDP作为一个阳性对照药物。
　　 结果发现:合成的各种多肽(10μM)加入RKO细胞后1小时后,共聚焦显微镜观察多肽的入胞情况:干扰功能域(分子靶向区多肽)未能进入细胞(胞浆或细胞核),而TAT、与TAT融合的随机肽(BTs1和BTs1)以及与TAT融合的分子靶向区多肽(BTw1、BTw2和BTw3)明显地被肿瘤细胞摄取。入胞后,主要分布于胞浆和细胞核。细胞动力学研究结果显示:融合多肽作用4小时后,荧光强度开始明显减弱(图2.2a)。各个多肽的细胞毒验证(MTT assay)结果显示:按final concentraton设置的浓度加入多肽(0,5,10,20,40,60,80μM)和及阳性对照药物顺铂(0,5,10,20,40,60,80μM),继续培养48h,多肽对肿瘤细胞均未表现出细胞毒作用(图2.3)。而顺铂随着加药浓度的增加对肿瘤细胞的抑制作用明显增加。
　　 基于MTT有关细胞毒试验的结果,我们可以选择10μM、20μM、30μM和40μM等低于80μM浓度的多肽作为下一步一系列试验的工作浓度。
　　 3融合多肽对放射敏感性影响的实验研究
　　 这一部分试验在体外(in vitro)应用克隆形成的方法(clony-forming assays)研究融合多肽对肿瘤细胞系(主要为RKO细胞)放射敏感性的影响。通过体外实验测量γ-H2AX焦点形成(γ-H2AX focus formation)研究融合多肽对肿瘤细胞DNA损伤形成损伤修复的影响。
　　 我们发现BTw1和BTw2对放射敏感性均无影响,而BTw3能够明显降低放射诱导的细胞生存。D0值代表37％肿瘤细胞存活的致死平均照射剂量。D0值是肿瘤细胞内在放射敏感性(intrinsic cellular radiosensi-tivity)的指标。RKO细胞在BTw3处理后的D0值为1.95Gy,随机肽(BTs2)处理后的Do值为2.46Gy。放射增敏比(SER)为1.25。结果提示BTw3对RKO细胞具有放射增敏作用。
　　 在0小时间点,未检测到γ-H2AX焦点,在照射0.5小时后,各组的γ-H2AX焦点数明显增加,且各组在0.5时间点的γ-H2AX焦点数无明显差异(P>0.05)。在1小时时间点BTw3组的γ-H2AX焦点数明显多于BTs1组(P=0.032),但与和BTs2组相比无明显差异(P=0.132)。在这一时间点,BTw3组的γ-H2AX焦点数均明显多于BTw1和BTw2组(P分别为0.031和0.009)。在2、4、8、24和48小时的时间点,BTw3组的γ-H2AX焦点数明显多于其他各组(单纯照射、BTs1、BTs2、BTw1和BTw2组)(P均小于0.00001)。根据结果我们可以推测:融合多肽加放射没有诱导或增加γ-H2AX焦点,但BTw3可能推迟了DNA双链断裂修复的时间,因而延长了γ-H2AX焦点存在的时间。结果提示BTw3对RKO细胞DNA双链断裂修复有抑制作用。
　　 总之,克隆形成试验和γ-H2AX foci试验结果均支持BTw3(T(2638)QQQHDPTLT(2647))对RKO细胞具有潜在的放射增敏作用。
　　 4融合多肽(TAT-QQQHDFTLT)放射增敏的分子生物学机制研究
　　 基于以上结果,我们进一步研究了BTw3对其对应的苏氨酸位点磷酸化的影响(如对T2647位点磷酸化的影响),以及BTw3对DNA—PKcs下游分子Artemis磷酸化的影响,以及BTw3对介导细胞凋亡Caspase家族关键的执行分子caspase-3的影响。
　　 结果提示:在照射20分钟时,DNA-PKcs T2647磷酸化程度变化不明显,然而在照射60分钟后,我们观察到DNA-PKcs分子T2647磷酸化程度明显降低(见图4.1)。
　　 我们研究Artemis蛋白对于电离辐射的效应,具体观察了融合多肽BTw3(TAT-T(2638)QQQHDFTLT(2647))联合放射对Artemis S516磷酸化的的影响,用Artemis S516磷酸化特异性抗体来检测和分析Artemis蛋白磷酸化的变化。结果显示:BTw3处理RKO细胞后照射10Gy,在照射后30分钟和60分钟,融合多肽BTw3明显抑制了Artemis S516磷酸化。
　　 细胞凋亡分析caspase-3的变化结果显示:BTw3联合放射与单独放射相比,可以明显增加cleaved caspase-3蛋白表达,说明BTw3可以进一步促进放射诱导的细胞凋亡。
　　 结论:
　　 1)MS分析各多肽的相对分子质量测定值与理论值相符。证明序列正确。确保了所合成的肽为高纯度目的肽。
　　 2)HPLC对合成多肽进行的纯度分析显示,所有合成多肽的纯度均在95％以上,符合高纯度多肽的合成要求。
　　 3)TAT或融合其他短肽时可穿膜进入细胞,并可定位于细胞质和细胞核,同时具有较高的入胞效率。而非穿膜肽则不能进入细胞。
　　 4)BTw1和BTw2对放射敏感性均无影响,而BTw3能够明显降低RKO细胞放射后的细胞生存。即BTw3对RKO细胞有潜在的放射增敏作用。
　　 5)BTw3明显延长了放射诱导γ-H2AX焦点(γ-H2AX foci)存在的时间
　　 6)克隆形成试验和γ-H2AX foci试验结果均支持BTw3(T(2638)QQQHDFTLT(2647))对RKO细胞具有潜在的放射增敏作用。
　　 7)BTw3(LAT-T(2638)QQQHDFTLT(2647))可以抑制放射诱导的RKO细胞DNA—PKcs分子T2647的磷酸化。
　　 8)BTw3(TAT-T(2638)QQQHDFTLT(2647))对放射诱导的RKO细胞ArtemisS516磷酸化具有抑制作用。
　　 9)BTw3联合放射与单独放射相比,可以明显增加cleaved caspase-3蛋白表达,说明BTw3可以进一步促进放射诱导的细胞凋亡。