鸡鸭感染H9N2亚型禽流感病毒后的免疫应答差异研究

摘要

鸡和鸭两者同属于鸟纲，均为禽流感病毒(AIV)的天然宿主。通常鸡对AIV较易感，特别是感染高致病性禽流感病毒(HPAI)后有明显的临床症状和很高的死亡率；鸭在感染HPAI后通常也不会表现出明显的临床症状，因此成为了病毒的“特洛伊木马”而到处传播病毒。在过去的50年中，对于鸡的研究比较广泛，已有很多试剂可用。但由于鸡和鸭的很多基因保守性较低，导致很多适用于鸡的试剂无法与在鸭的研究中使用。故对于鸭的免疫系统研究相对滞后。
　　 本研究根据NCBI数据库中鸭CD3ε(dCD3ε)、CD4(dCD4)和CD8α(dCD8α)基因序列设计引物，分别扩增出了全长为537 bp、1449 bp和714 bp的开放阅读框(ORF)。在此基础上，扩增基因去除信号肽序列的胞外区片段构建pET重组表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE和Western blot鉴定结果显示：在大肠杆菌中得到成功表达的重组dCD3ε(rdCD3ε)、dCD4(rdCD4)和dCD8α(rdCD8α)胞外区蛋白的分子量大小分别约为33kDa、45kDa和23kDa。
　　 将镍柱变性纯化的蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠分别制备抗rdCD3ε、rdCD4和rdCD8α的单克隆抗体(mAb)。Western blot检测结果显示，所有分泌抗体的细胞上清均能与相应的重组蛋白发生反应。通过间接免疫荧光(IFA)进一步筛选鉴定识别内源性的mAbs，分别获得了2株(4H3、1C3)能稳定分泌抗dCD3ε mAb的细胞、4株(1A11、1F7、2D7和3F12)能稳定分泌抗dCD4 mAb的细胞和1株(5E4)能稳定分泌抗dCD8α mAb的细胞。激光共聚焦结果显示：这些mAbs所结合的dCD3ε、dCD4和dCD8α蛋白均表达于鸭外周血单个核细胞(PBMC)的细胞膜表面。这些结果显示：我们成功获得了抗鸭CD3ε、CD4和CD8α的单抗。
　　 以制备的mAbs为工具，利用流式检测技术对鸭CD3、CD4和CD8的表型细胞进行了分析，结果显示：CD3ε+细胞在PBMC中占69.7％、在脾单个核细胞(SMC)中占57.51％、在胸腺细胞中占58.84％、在法氏囊细胞中为0；CD4+细胞在PBMC中占37.56％、在SMC中占30.05％、在胸腺细胞中占51.6％、在法氏囊细胞中为0；CD8α+细胞在PBMC占45.17％、在SMC中占50.86％、在胸腺细胞中占69.9％、在法氏囊细胞中占34％。分别用fluor488、PE和APC对抗鸭CD3ε、CD8α及CD25单抗进行标记。多色流式分析表明，PBMC中CD4-和CD8+T细胞分别约为27％和33％，CD25分子的表达约占4％和8％的CD4-T细胞和CD8+T细胞；SMC中CD4+和CD8+T细胞分别约为37％和40％，CD25分子表达于约占5％和11％的CD4+T细胞和CD8+T细胞；胸腺细胞中CD4+和CD8+T细胞分别约为67％和55％，CD25分子表达约占4％和3％的CD4+T细胞和CD8+T细胞。这些结果首次揭示了鸭PBMC、SMC、胸腺细胞及法氏囊细胞中免疫细胞的生理分布。
　　 以H9N2 AIV(106EID50/0.1mL)感染30日龄无H9N2血清抗体的SPF来航鸡和番鸭。攻毒后不同时间分别处死接种和对照组动物，采集抗凝血、血清、脾脏、胸腺和法氏囊进行分析。流式细胞分析显示，CD4+T细胞仅在鸭胸腺细胞中具有显著的增长，之后处于下调状态，在两者的PBMC和SMC中则没有明显的上调，甚至略有下调。鸭CD8+T细胞在PBMC、SMC和胸腺细胞中有显著的上调，鸡的CD8+T细胞仅在PBMC中有显著上调，且持续时间较鸭短。有趣的是，鸡、鸭的CD8+CD25+T细胞在感染过程中呈现了显著的上调趋势。这不仅提示CD8+T细胞在H9N2 AIV感染过程发挥了重要功能，而且也说明CD8+CD25+T细胞参与了H9N2 AIV感染过程的调节。Quantitative real time PCR结果显示：Toll样受体(TLRs)在感染早期在鸭中的表达较鸡更显著。促炎性因子IL-1B、IL-6和IL-17在鸭外周免疫系统PBMC、脾脏中的表达较鸡更为显著，而在中枢免疫系统胸腺和法氏囊中的表达较鸡而言则受到了显著的抑制。MHCⅠ类和Ⅱ类分子在鸡中有更为显著的表达。Th1型细胞因子IL-2在感染早期在鸭中的表达更为显著，而到后期则多受到了抑制，而IL-18则在鸭胸腺和法氏囊中的表达更为显著，在脾脏中的表达则显著低于鸡。IFN-α在鸡和鸭中均有明显的上调，尤以在鸭中的表达更为显著，而随着时间的推移，其在鸭中的表达逐渐下调，显著低于鸡；IFN-γ除了在法氏囊中较鸡有显著抑制外，在多数时间点在鸭中的表达显著高于鸡。BAFF在鸭脾脏和法氏囊中的表达较鸡更为显著。这些结果显示，鸭感染H9N2 AIV后，其外周免疫系统中先天免疫应答和适应性免疫应答(尤其是细胞免疫应答)均强于鸡，而中枢免疫系统的应答强度则显著低于鸡，表明在感染H9N2 AIV后，两种宿主的细胞因子变化趋势的不一致和细胞免疫应答的差异。
　　 综合上述，说明，鸡和鸭在免疫应答中存在着明显的差异，鸭的免疫系统能更好地识别AIV的入侵，起始先天免疫应答，促炎性因子和IFNs的上调表达也许有利于促进机体的免疫应答，且在适应性免疫应答中，对清除病毒具有关键作用的CD8+T细胞在PBMC和SMC中的持续增长有利于控制病毒的复制和扩散，从而保护机体；而在鸡中，TLRs的上调幅度较小，使之不易识别入侵的AIV，促炎性因子和IFNs的小幅上调则可能无法充分激活机体的免疫应答，同时在适应性免疫应答中，IL-2的表达较弱，CD8+T细胞也仅在PBMC中有显著增长，但持续时间较短，导致宿主的免疫应答相对较弱，这也许使病毒能更容易逃避宿主的免疫应答，在机体内复制和扩散。这些差别可能是由于两种宿主的基因组差异以及宿主与病毒间互作产生的不同结果而导致的。在鸡中可能缺失了某些抗病毒基因或通路，或者某些通路更容易被病毒所利用进行复制组装运输等，从而导致免疫应答受到抑制。本研究揭示了鸡和鸭在感染H9N2 AIV后呈现出程度不同的免疫应答，鸡的免疫应答总体偏弱，而鸭的免疫应答则较为强烈，这也许可以在一定程度上解释为何鸭一般对AIV比较耐受，而鸡却较易感，甚至死亡。