猪生长激素(pGH)的基因克隆及其毕赤酵母(Pichia pastoris)真核表达系统的构建

摘要

生长激素(GH)生理功能非常广泛，它几乎可以影响到机体所有类型的组织器官，包括骨、软骨、脂肪组织、免疫系统、生殖系统、脑组织和造血系统。本研究从40日龄的长白猪脑垂体中克隆了猪生长激素(pGH)基因，用毕赤酵母真核表达系统表达了重组猪生长激素，并研究了表达产物的生物学活性。主要有以下研究结果：
　　 1.摘取40日龄的长白猪脑垂体，从中提取总RNA，经过RT-PCR扩增，得到了猪生长激素(pGH)基因编码序列(Acession N0.JF742642)。DNA电泳结果显示，其条带分子量大小与理论值651 bp相符，测序结果表明，其核苷酸序列与Genebank报道的目的基因100％相似，证实已经正确克隆pGH目的基因。
　　 2.根据酵母真核表达载体特征重新设计引物，克隆获得pGH基因的成熟肽编码序列(570 bp)，定向插入毕赤酵母真核表达载体pPICZαA和pGAPZαA。DNA测序结果表明重组表达载体pPICZαA-pGH和pGAPZαA-pGH连接方向正确，且序列没有发生移码。将此重组表达载体线性化后通过电击转化至GS115酵母感受态细胞，用含有Zeocin的YPD培养基筛选重组子，提取鉴定酵母基因组，PCR扩增电泳鉴定的结果可以看出重组酵母GS115基因组以特定基因引物扩增出586 bp左右的条带与理论的结果相符，以通用引物扩增的1100 bp左右及1040 bp左右的条带也均符合理论值，说明重组酵母菌构建成功。
　　 3.将鉴定的阳性重组酵母用不同浓度的Zeocin(基本浓度100μg/mL)抗性平板筛选多拷贝子，结果显示随着Zeocin浓度的提高，重组酵母的生长状况呈递减趋势，能够在较高抗性浓度(Zeocin浓度>1200μg/mL)平板上较好生长的重组酵母为编号P14的pPICZαA-pGH-GS115重组酵母和编号为G1400，G2400，G3400，和G4400的pGAPZαA-pGH-GS115重组酵母，选取用于进行蛋白表达。
　　 4.高抗Zeocin的重组酵母菌株进行培养表达目的蛋白。高抗菌株pGAPZαA-pGH-GS115 G1400、G2400、G3400和G4400的表达分泌上清液SDS-PAGE结果显示，其蛋白表达量均高于阳性对照，且G2400在26 KD处可见与理论分子量大小相符的目的蛋白。相应的Western-blot结果也显示，G1400，G2400，G3400和G4400均在26 KD处有特异性条带出现。
　　 5.高抗重组菌pGAPZαA-pGH-GS115和pPICZαA-pGH-GS115接种培养，在不同时间取样，SDS-PAGE分析显示，随着时间的推移，pGAPZαA-pGH-GS115和pPICZαA-pGH-GS115的pGH表达量均在96 h最高，在120 h反而降低，说明96 h是较为理想的分泌上清收集时间。且相对应的Western-blot分析显示，26KD左右均出现特异性条带，与理论大小相符。
　　 6.将96 h收集的高产菌株的分泌上清经过Ni++柱亲和纯化以获得目的蛋白的纯化样品。纯化结果SDS-PAGE分析显示，pPICZαA-pGH-GS115分泌上清用Elution buffer洗脱收集的蛋白样E1，E2，E3均有特异性蛋白条带出现，且E1中浓度最高，选为下一步活性分析的样品。pGAPZαA-pGH-GS115分泌上清的目的蛋白在E2和E3中比较集中，且E2的浓度最高，选为下一步活性分析的样品。猪生长激素蛋白纯化样品和标准BSA对照，计算出纯化收集的pGH浓度均约为8 mg/L左右。
　　 7.将选定的纯化蛋白样品用受体夹心Elisa方法进行生物活性分析，结果显示，猪肝脏膜受体和表达的猪生长激素发生特异性结合。当猪生长激素量一定时(3μg/mL)，随着猪肝脏膜受体浓度的提高，光密度值也相应提高；当以加热煮沸失活的猪生长激素和活性肝膜受体结合时，其光密度值显著下降。从而说明本研究表达获得的猪生长激素具有生物活性。