基因改造和驯化细菌利用水葫芦发酵联产氢气和甲烷的机理研究

摘要

随着化石能源的日益短缺和环保要求的逐渐提高，氢能作为清洁、高效的可再生能源载体越来越受到人们的重视。利用生物质原料通过细菌发酵方法制取氢气新能源具有很强的应用前景，而通过基因工程和代谢调控手段改造产氢细菌是生物制氢领域的研究热点。本文在国际上首次测得阴沟肠杆菌在过表达产氢增强基因后的氢酶活性提高了97.4％，利用混合菌群驯化和微波稀酸水解联合活性炭脱毒使水葫芦发酵产氢量提高了111.1％；500升半连续中试得到水葫芦发酵联产氢气和甲烷的能源转化效率达到51.3％。
　　本文首先以高效产氢细菌阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae CICC10017和产气肠杆菌Enterobacter aerogenes ATCC13408为主要研究对象，对其过表达外源产氢增强基因后的氢酶活性、利用葡萄糖的产氢能力和代谢途径进行了研究。阴沟肠杆菌E.cloacae CICC10017在过表达了一种产氢增强基因后，氢酶活性由原来的270.93 ml-H2/(g-DW·h)提高到了534.78 ml-H2/(g-DW·h)，单位底物产氢量也由1.29 mol-H2/mol-葡萄糖提高到了2.54mol-H2/mol-葡萄糖，产氢量提高了97.9％。改造菌的发酵液中乙酸和丁酸的产量增加，乙醇产量减少，这与产氢量高时的NADH代谢机理是一致的。产气肠杆菌Enterobacteraerogenes ATCC13408在过表达氢酶hyc操纵子大、小亚基的基因后，氢酶活性分别提高了124％和67％，氢气产量也由1.16 mol-H2/mol-葡萄糖分别提高至2.16 mol-H2/mol-葡萄糖和1.97mol-H2/mol-葡萄糖；在过表达了蓝藻Synechocystis Sp.PCC6803氢酶hoxUYH基因后，氢酶活性提高了153.8％，氢气产量由1.27 mol-H2/mol-葡萄糖提高到2.39 mol-H2/mol-葡萄糖。在此基础上又进行了基因改造细菌利用预处理水葫芦产氢的实验研究，过表达产氢增强基因后的阴沟肠杆菌利用水葫芦产氢能力最高，产量为74.9 ml-H2/g-TVS。
　　本文针对木质纤维素、蛋白质和油脂等三大类复杂有机物的发酵联产氢气和甲烷特性开展了研究。利用生物质原料对混合菌群进行驯化培养加强优势菌种的适应性。对大分子有机物强化水解得到易于发酵的小分子原料。16S rDNA分析结果表明，混合菌种经过木糖驯化培养富集，种群多样性更高，多种梭菌属并存为优势菌种，种群多样性提高使木糖的产氢量提高了45％。木糖联产氢气和甲烷量为190.6 ml-H2/g-木糖和216.5 ml-CH4/g-木糖，联产的能源转化率达67.48％。乳蛋白联产氢气和甲烷量为136.5 ml-H2/g-TVS和157.8ml-CH4/g-TVS，联产的能源转化效率为41.9％。
　　水葫芦经过稀酸/微波/酶预处理工艺，其水解糖化率可以达到91.36％，从而使水葫芦发酵产氢量比常规的酶水解显著提高了62.8％，而采用混合菌群驯化后使水葫芦发酵产氢量提高了95.5％，进一步使用活性炭脱毒后使水葫芦发酵产氢量提高了111.1％。水葫芦暗发酵得到氢气产量为134.9 ml-H2/g-TVS，利用其产氢废液继续联产甲烷量为107.7ml-CH4/g-TVS。利用50升和500升的两个串联发酵罐实现了水葫芦发酵联产H2和CH4的半连续流中试，得到连续稳定的氢气和甲烷产生速率分别为340.9±36.6 m1-H2/(L·d)和184.3±10.4 ml.CH4/(L·d)。利用混合菌群驯化和微波稀酸水解使水葫芦中试联产氢气和甲烷的能源转化效率提高到51.3％。