水稻OsiICK1和OsiICK6分子特征分析及过表达OsiICK6对植株生长和发育的影响

摘要

细胞分裂及其周而复始的循环是植物(包括其它生物)生长发育的基本动力。正常的细胞周期,即从上一次分裂结束到下一次分裂结束为止的活动过程,是由一种高度保守的分子机制调控。细胞周期依赖激酶抑制因子(Inhibitors of Cyclin-dependent Kinase,ICKs)即是这种分子调控机制中重要的一环.在水稻上,根据基因组序列预测的粳稻和籼稻ICK基因各有6个。目前,除了个别粳稻ICK基因-Orysa；KRP1和Orysa；KRP3的功能得到验证之外,其它粳稻和籼稻ICK基因的功能分析尚未开展。本研究以籼稻ICK基因为研究对象,运用现代生物学手段对其进行了蛋白质序列聚类、亚细胞结构定位和蛋白质相互作用分析,并在此基础上,利用本实验室自主克隆的一个表达强度中等的33kDa分泌蛋白启动子(33kDa secretary protein promoter,33SP)对其中的一个籼稻ICK基因进行了有限的过量表达和表型观察。所获得的主要结果和结论如下
　　 (1)、蛋白质序列聚类分析结果表明:6个籼稻ICKs和已经报道的粳稻ICKs一样可以分成两类,其中,ICK1-4为第一类,ICK5和6为第二类。进一步的保守功能域分析结果显示:除了基序1和2外,其它3个基序也都呈现在籼稻ICK蛋白上,唯有ICK4缺失这后3个基序。另外,除了ICK5之外,其它5个籼稻ICK蛋白都具有核定位信号。为了与粳稻ICKs的命名相区别,我们将籼稻的ICKs依次定名为OsiICK1-6,它们与粳稻ICKs的对应关系是:OsilCK1／Orysa；KRP1,OsilCK2／Orysa；KRP2,OsilCK3／Orysa；KRP3,OsiICK4／Orysa；KRP6 OsilCK5／Orysa；KRP5和OsilCK6／Orysa；KRP4。本研究选用作过量表达分析的ICK基因为OsiICK6,它与功能已知的OsiICK1分属不同的聚类。
　　 (2)利用酵母双杂交技术对OsiICK6与不同的CDKs及Cyclins的相互作用情况进行了分析,结果表明:当用AD-ICKs和BD-CDKs／cyclins共转化酵母菌株May203时,OsiICK1和OsiICK6都可以与CYCD2；1相互作用,但是它们与CDKA；1,CDKB2；1,CYCA2；1,CYCB2；2都没有相互作用.反过来用BD-ICKs和AD-CDKs／Cyclins共转化酵母时,OsiICK1和OsiICK6都和CYCD2；1有相互作用,同时,OsiICK6与CDKA；1有相互作用,而OsiICKl与CDKA；1不互作。
　　 (3)利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)进行的亚细胞定位结果表明:OsiICK1和OsiICK6都定位在核内,说明他们主要在核内起作用。然而,仔细的观察发现OsiICK6在核内的分布是不均匀的,成亮点分布,而OsilCK-1在核内的分布则比较均匀。
　　 (4)荧光实时定量PCR分析结果表明:OsilCK6在检测的根、茎、叶组织和幼穗和小花器官中都有表达,且在叶片中的表达量最高。
　　 (5)将33SP驱动的OsilCK6导入籼稻恢复系明恢63中进行有限度的过量表达,结果显示:其转化体及其后代植株明显矮化,叶片交窄外卷,发育至3核的花粉粒比对照显著减少,大量种子不能结实,或即便结实,但种子的发育也出现异常.进一步的茎组织纵切和叶组织横切观察结果发现,OsilCK6过表达植株的细胞体积增大,但数目减少.对叶片进行扫描电镜观察还发现,OsiICK6过表达植株的叶片近轴面气孔比对照变大,而远轴面的变化不大,同时发现远近轴面的气孔列也比对照少一半。
　　 综上所述,OsiICK6在分子序列特征、亚细胞结构定位和蛋白质相互作用方面都与OsiICK1存在差异,其过量表达对水稻植株的生长和花粉及种子的发育有显著影响。