氨基多糖纳米微粒调节ICR小鼠免疫及抗氧化损伤的研究

摘要

氨基多糖(chitosan，CS)是一种线性聚阳离子多糖，为甲壳素脱乙酰化产物，大量存在于海洋节肢动物甲壳中，是年产量仅次于纤维素的多糖。与甲壳素相比，氨基多糖具有毒性低，溶解性好，可生物降解，免疫原性低、生物相容性好等优良特性，广泛应用于医药、农业、食品等行业。近年来，氨基多糖纳米微粒系统倍受生物医学和药学等领域关注。前期研究发现氨基多糖纳米化后增强了其抗肿瘤、抗菌效果。为探讨氨基多糖纳米微粒的免疫调节作用，本课题研究了氨基多糖纳米微粒(CNP)对OVA免疫小鼠免疫调节作用及其细胞、分子水平免疫调节作用机理；建立H2O2诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞氧化损伤模型，研究了氨基多糖纳米微粒对细胞氧化损伤的保护作用；并采用分子生物学技术研究了氨基多糖纳米微粒发挥抗氧化活性的可能分子机制。研究结果如下：
　　 1、氨基多糖纳米微粒(CNP)制备与表征
　　 试验采用离子凝胶法，用三聚磷酸钠(TPP)与一定脱乙酰多的氨基多糖(CS)反应成功制备了氨基多糖纳米微粒(CNP)，原子力显微镜和表面电位分析仪扫描与测定结果表明，制备的CNP形态呈均匀球形颗粒，具有粒径小和表面具有正电位，能均匀、稳定分散于溶液体系中的特点。平均粒径为83.66nm，粒径范围为63.16-101.70nm；平均电位为+35.43 mV，平均表面电位范围为20.04-51.13 mV。
　　 2、氨基多糖纳米微粒(CNP)对小鼠的免疫调节作用研究
　　 采用ELISA法测定了OVA受免小鼠的特异性抗体IgG及其亚类的效价。结果表明，CNP增强了OVA受免小鼠的特异性抗体IgG及其亚类，呈一定的量效关系，100μg剂量效果显著(P<0.05)。MTT分析发现50、100μg剂量CNP均显著增强Con A、LPS和OVA诱导的OVA受免小鼠淋巴细胞增殖反应(P<0.05)；通过分离得到的脾细胞为效应细胞与K562细胞为靶细胞共培养实验发现，各剂量CNP组均显著提高OVA受免小鼠NK细胞的杀伤活性(P<0.05)，且CNP显著高于非纳米化组CS组(P<0.05)。ELISA检测分析发现，与OVA抗原组相比，CNP各剂量组均显著提高了脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-2水平(P<0.05)，分别为155.20 pg/mL和115.00 pg/mL、177.26 pg/mL和147.20 pg/mL以及239.52 pg/mL和198.53 pg/mL，且显著高于非纳米CS组(P<0.05)，并呈一定量效关系；CNP显著增强了OVA受免小鼠脾细胞培养上清液中IL-10的水平(P<0.05)，分别为127.28 pg/mL、135.73 pg/mL和136.53pg/mL，均显著高于CS组(P<0.05)。与OVA抗原组相比，50、100μgCNP显著增加了受免小鼠血清中IFN-γ和IL-2的浓度(P<0.05)，分别为209.06 pg/mL和146.91pg/mL、211.92pg/mL和185.68pg/mL；25、50、100μgCNP和50μgCS均显著增加了受免小鼠血清中IL-10的浓度(P<0.05)，分别为342.22 pg/mL、368.96 pg/mL、387.34pg/mL和217.99pg/mL，CNP各处理组对血清细胞因子水平的作用效果均显著高于CS组(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示CNP不仅显著增强了Th1细胞因子IL-2和IFN-γ的表达(P<0.05)，同时促进了Th2免疫反应类型的细胞因子(IL-10)基因的表达(P<0.05)。结果提示，CNP显著上调了OVA受免小鼠的Th1/Th2两类免疫反应的细胞因子IL-2、IFN-γ，和IL-10基因表达，增强了OVA受免小鼠的体液免疫，并引起了平衡的Th1/Th2细胞免疫反应，CNP可能通过上调T细胞表达相关细胞因子介导机体产生有效的体液和细胞免疫。
　　 3、氨基多糖纳米微粒(CNP)对小鼠巨噬细胞的免疫调节及其机制研究
　　 采用单因子试验建立RAW264.7小鼠巨噬细胞，研究CNP对RAW264.7小鼠巨噬细胞的免疫调节及其机制。研究结果表明，100μg/mL CNP处理组细胞因子TNF-α水平呈先上升后下降的模式，在10h时达到峰值；100μg/mL CNP处理RAW264.7细胞20 h时，细胞因子(TNF-α、IL-1)基因表达水平显著高于空白对照组和其他剂量组(P<0.05)，相对表达量分别为64.32A±2.19、82.17±4.64；短时动力学曲线显示100μg/mL CNP增加了细胞内第二信使钙离子浓度，细胞经抑制剂TAK-242处理后，胞内钙离子浓度明显减低，抑制了CNP对巨噬细胞RAW264.7的激活作用；100μg/mL CNP显著提高了细胞因子TNF-α和NF-κB出的mRNA表达丰度。结果提示CNP增强了RAW264.7巨噬细胞的细胞因子分泌能力，且呈一定的量效和时效关系，其峰值为100μg/mLCNP处理细胞10 h，CNP对巨噬细胞系RAW264.7有较强的免疫调节作用，其作用机制可能通过调节胞内钙离子变化，并由Toll样受体4(TLR4)介导细胞内信号。
　　 4、氨基多糖纳米微粒(CNP)对H2O2诱导小鼠巨噬细胞氧化损伤的保护作用
　　 通过建立H2O2诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞氧化损伤模型，研究了氨基多糖纳米微粒(CNP)对细胞氧化损伤的保护作用及其机制。结果表明，与对照组相比，500μmol/LH2O2作用12h显著降低了细胞的相对存活率(P<0.05)；与H2O2作用组相比，CNP显著降低了细胞乳酸脱氢酶(LDH)渗漏率、细胞外LDH活性(P<0.05)，且有一定的剂量效应，其中100μg/mL CNP效果最佳；与H2O2处理组相比，100μg/mL CNP能显著的增强总抗氧化能力(T-AOC)、胞内SOD和GSH-Px的活性和减低胞内MDA和NO含量，提高细胞的活力，氧化损伤的细胞结构和形态趋于正常，显示出一定的氧化保护效果。荧光定量PCR法检测结果表明：随着CNP浓度的增加，细胞内GSH-Px和Mn-SOD基因mRNA表达水平显著增加(P<0.05)，其中100μg/mL CNP效果最佳，与阳性对组(250μg/mL Vc)相当。结果提示，氨基多糖纳米化后显著增强了其抗氧化活性，这可能与其结构改变、表面质子化有关。氨基多糖纳米微粒(CNP)增强抗氧化酶(GSH-Px和Mn-SOD)的基因表达及其活性，提高细胞抗氧化剂能力，修复H2O2诱导的氧化损伤RAW264.7小鼠巨噬细胞的形态机构。
　　 综上所述，氨基多糖纳米化后能显著增强受免小鼠的特异性免疫反应，其作用机制可能是氨基多糖纳米微粒通过调节免疫细胞相关细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-10基因表达和分泌，调节平衡性的Th1/Th2免疫反应；氨基多糖纳米微粒可能通过RAW264.7细胞表面Toll样受体4介导以及调节细胞第二信使钙离子胞内水平，激活了RAW264.7细胞的免疫功能；氨基多糖纳米后增强细胞抗氧化酶(GSH-Px和Mn-SOD)的基因表达及其活性，显著增强了其抗氧化活性，保护RAW264.7小鼠巨噬细胞形态结构免受H2O2的氧化损伤，这可能与氨基多糖微粒结构改变、表面质子化有关。本研究研究了氨基多糖纳米微粒的免疫调节和抗氧化活性，从细胞、分子水平，探讨了其免疫调节和抗氧化的作用机制，旨在阐明氨基多糖纳米微粒的生物学效应，为其开发利用提供科学依据。