具有手性选择性酯酶/脂肪酶的筛选、催化特点及应用研究

摘要

手性是自然界最重要的属性之一，分子手性识别在生命活动中起着极为重要的作用。同一化合物的两个对映体之间不仅具有不同的光学和物理化学性质，而且它们具有不同的生物活性。获得手性化合物的传统方法之一是利用拆分试剂对外消旋底物进行拆分或者不对称水解。然而，使用化学拆分试剂对消旋化合物进行拆分需要耗用大量的手性拆分试剂，成本压力大且环境不友好。酶催化下的不对称合成及拆分反应具有环境友好，反应条件温和以及选择性好等特点。目前的手性化合物制备方法中，应用较多的主要是脂肪酶，但脂肪酶昂贵的价格限制了其规模化应用。长期以来，人们一直寻找用以替代脂肪酶的酯酶，在具有类似的催化能力和催化特性时，使用制备成本较低的酯酶替代脂肪酶使得低成本制备手性化合物更具可行性。
　　 本文重点研究，两类手性化合物（S)-3-羟基戊二酸单酯类化合物和手性1-苯乙醇类化合物的生物制备，手性酯酶/脂肪酶的筛选及催化特点。以其为主线，展开了下面六个方面的工作，具体为：
　　 (a)选择适合反应的生物酶催化剂，首先需要对酶进行筛选。利用已经建立的酶库，我们开发了一个基于真实底物的荧光高通量筛选方法。相对于目前的高通量筛选体系，该筛选体系具有可靠、精确和灵敏度高等优点。通过已建立的高通量筛选方法，我们筛选到了一种高活性和高选择性的水解酶(酯酶Escherichia coli BioH)。
　　 (b)将筛选得到的酯酶应用到仲醇类化合物的拆分中。该酶对仲醇类化合物具有非常好的手性选择性，水溶液中可以将一系列仲醇乙酸酯进行较好的拆分，ee值最高可达到98％。令我们感兴趣的是，该酯酶具备一些目前为止所发现酯酶所不具备的性质-非水溶剂中长时间保持活性及选择性。将该酶应用于有机相中的转酯化拆分苯乙醇类化合物中，得到的转酯化产物的ee值最高为＞99%。
　　 (c)然后尝试由筛选得到的酯酶和实验室现有的7种酯酶和脂肪酶应用到手性戊二酸单酯类化合物的不对称合成中。结果显示只有CALB和LipozymTLIM能够催化该反应。通过比较反应活性，固定化酶投料量大小及反应时间等因素，最后确定了CALB为该反应所使用的生物催化剂。为了减轻工作强度，我们采用了分子对接技术预测并指导反应，结果显示分子对接预测结果与实际反应结果较为接近。分子对接能较为准确的预测并指导该生物合成是否能进行，但是不能预测酶的底物构型选择性。
　　 (d)将酯酶和脂肪酶二者联合应用于手性醇的绿色，连续拆分中。该方法基于以下策略：将酶能催化转化的异构体完全转化为对应的化合物，可以将剩下的另一异构体的ee值保持在较高值，然后在CALB的催化作用下，有机溶剂中利用NH3作为脱酰试剂对转酯化产物进行氨解（脱酰）反应。实际试验中，未反应的醇的ee值可达到≥98%。经过再次的酶选择性催化，富手性的酯脱酰基得到ee值为≥99%的R构型手性醇，即使ee值低于90%的酯经过氨解脱酰基反应后，ee值也得到了大幅提高，可达到≥99%。实验中所使用的有机溶剂，酰基供体以及固定化酶都能重复利用。这种绿色脱酰基方法避免了使用缓冲溶液水解相应的酯而产生的大量废水和盐溶液，也避免了化学脱酰基过程中使用大量化学试剂对环境造成污染和异构体的消旋化。
　　 (e)根据本论文相关章节中酯酶和脂肪酶可催化的底物及反应类型-酯酶和脂肪酶不但能催化其所能接受的传统的底物及催化类型，还能够催化一些新的底物及反应类型，我们总结了本论文中涉及的部分酶催化的反应，对酶的模糊性催化性质进行了初步归纳和论证。最后，总结了研究底物多样性的前景及其对手性化合物的制备具有的积极意义。
　　 (f)根据本论文的实验数据以及部分文献中的报道数据，我们对酯酶和脂肪酶在底物手性选择性方面的区别进行了初步的探讨，从对酯酶和脂肪酶手性选择性的各种影响因素方面对酯酶和脂肪酶在手性选择性方面的区别进行了对比和总结，阐述了二者之间的区别及联系，并进行了总结。文中同时验证了文献中报道的E.coli BioH酶是一个类脂肪酶的酯酶（在底物的选择性方面比较接近酯酶，在催化环境方面具有优秀的非水溶剂催化活性，这比较接近与脂肪酶）的说法。