非水相催化手性醇不对称拆分的立体选择性脂肪酶的快速定量筛选方法

摘要

本发明公开了一种非水相催化手性醇不对称拆分的立体选择性脂肪酶的快速定量筛选方法，利用脂肪酶在无溶剂体系中分别催化脂肪酸乙烯酯与两种立体构型的手性醇之间的转酯化反应，反应4-24小时后，吸取50μl两种构型手性醇的反应液用100μl品红醛在微量比色皿或多孔微孔板中显色，用比色法于500-540nm处测定吸光度或直接用酶标仪于500-540nm处测定吸光度，以确定乙醛的生成量，并根据两种立体构型的手性醇反应生成乙醛的量计算产物对映体过剩量、底物对映体过剩量和酶立体选择性，筛选出生产立体选择性脂肪酶的目的菌株。本发明简单易行、快速方便。

说明书

技术领域

本发明涉及一种非水相催化手性醇不对称拆分的立体选择性脂肪酶的快速定量筛选方法。 

背景技术

脂肪酶作为一种三酰基甘油水解酶，具有一定的位置专一性和立体专一性，脂肪酶催化外消旋体动力学拆分是手性拆分领域中极具吸引力且发展非常迅速的重要技术。在有机溶剂中，脂肪酶除了具有高的催化活性和热稳定性外，还具有高度的对映体选择性和配基的广阔底物专一性。随着非水相酶学的不断深入和发展，脂肪酶已经成为非水相生物拆分过程中的高效催化剂，成功用于许多重要的手性仲醇的拆分。但是，脂肪酶种类多，催化特性千差万别，所以有目的的选择所需要的脂肪酶是手性拆分的关键。 

手性拆分用酶的筛选取决于酶的立体选择性，目前对于酶立体选择性的测定主要是针对被拆分的物质特点采用气相色谱法或液相色谱法，设备运行和维护费用高，检测周期长；并且用于筛选工作时需要大量的实验和时间消耗，导致筛选效率不高。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单易行、快速的非水相催化手性醇不对称拆分的立体选择性脂肪酶的快速定量筛选方法。 

本发明的技术解决方案是： 

一种非水相催化手性醇不对称拆分的立体选择性脂肪酶的快速定量筛选方法，其特征是：利用脂肪酶在无溶剂体系中分别催化脂肪酸乙烯酯与两种立体构型的手性醇之间的转酯化反应，所述脂肪酶是采用由脂肪酶生产菌制备成的细胞冻干粉或发酵液冻干粉；反应4-24小时后，吸取50μl两种构型手性醇的反应液用100μl品红醛在微量比色皿或多孔微孔板中显色，用比色法于500-540nm处测定吸光度或直接用酶标仪于500-540nm处测定吸光度，以确定乙醛的生成量，并根据两种立体构型的手性醇反应生成乙醛的量计算产物对映体过剩量、底物对映体过剩量和酶立体选择性，筛选出生产立体选择性脂肪酶的目的菌株。 

所述脂肪酸乙烯酯是脂肪酸链长为C₁-C₁₆的脂肪酸乙烯酯。 

转酯化反应条件为：手性醇浓度为0.001-1.5mmol/ml，反应温度30-60℃，反应时间4-24小时，摇床转速200转/分钟，脂肪酶浓度为10-1500U。 

所用多孔微孔板为96孔微孔板。 

品红醛的配制方法： 

称取碱性品红0.075g溶于少量80℃热蒸馏水中，使之充分溶解，待溶液冷却后过滤，加入5.3g Na₂SO₃，1.5ml浓硫酸，并移入100ml容量瓶中，摇匀，放气，定容至100ml；放置暗处，静置24h，溶液褪色且清亮透明，于4℃冰箱中避光保存。 

反应原理 

所用底物脂肪酸乙烯酯为：碳酸乙烯酯，乙酸乙烯酯，丙酸乙烯酯，辛酸乙烯酯，壬酸乙烯酯，癸酸乙烯酯，月桂酸乙烯酯，或棕榈酸乙烯酯等，优选乙酸乙烯酯。所用底物醇为手性醇。 

本发明建立了一种非水相催化手性醇不对称拆分的立体选择性脂肪酶的快速定量筛选方法，该方法适用于立体选择性脂肪酶生产菌的筛选。所用溶剂和转酯化反应试剂脂肪酸乙烯酯价格低廉，容易获得，测定方法简单，能同时进行大量脂肪酶的定量测定筛选。对任意选取的6种脂肪酶转酯化反应液采用气相方法进行检测，与本测定方法进行比较，证明了本测定方法的可行性。对商品化脂肪酶PSL、Novozyme435和CAL采用本测定方法进行了详细研究，在确定最佳测定条件的同时也验证了本方法能有效测定非水相中脂肪酶催化手性醇不对称拆分的立体选择性。 

本发明与传统的脂肪酶立体选择性筛选方法相比，突出了非水相中脂肪酶的立体选择性的测定。将本发明用于非水相立体选择性脂肪酶生产菌的直接筛选，将会得到目的性更强，更适合于非水相催化的脂肪酶生产菌。与国际上已有的有关脂肪酶立体选择性测定与筛选方法相比，无需气相色谱、液相色谱、旋光仪、质谱仪，无需价格昂贵的荧光底物和荧光分光光度计，且可以同时进行大量脂肪酶的定量测定筛选。 

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 

图1是本发明方法（即方法Ⅰ）与方法Ⅱ的相关度示意图。 

方法Ⅰ：比色法测定脂肪酶立体选择性；方法Ⅱ：气相色谱法测定脂肪酶立体选择性。 

具体实施方式

实施例1： 

采用乙酸乙烯酯与R/S-1-辛烯-3-醇、R/S-1-苯乙醇、R/S-薄荷醇、R/S-2-辛醇、R/S-芳樟醇作为底物，对六种商品化脂肪酶进行了详细的研究，以说明测定方法的可行性。 

试剂及脂肪酶： 

Novozyme435(lipase from Candida antarctica)诺维信公司； 

PSL（Lipase PS"Amano"IM，lipase from Brukholderia cepacia）Amano Pharmaceutical公司； 

CRL（lipase from Candida rugosa）Sigma公司； 

CAL（lipase from Candida antarctica）Sigma公司； 

PPL（lipase from Porcine Pancreas）Sigma公司， 

PCL（lipase from Pseudomonas cepacia）Sigma公司。 

R/S-1-辛烯-3-醇，R/S-1-苯乙醇，购于Acros公司，R/S-薄荷醇，R/S-2-辛醇，R/S-芳樟醇购于Sigma公司。其他试剂均为分析纯或者色谱纯。 

品红醛配制： 

称取碱性品红0.075g溶于少量80℃热蒸馏水中，使之充分溶解，待溶液冷却后过滤，加入5.3g Na₂SO₃，1.5ml浓硫酸，并移入100ml 容量瓶中，摇匀，放气，定容至100ml。放置暗处，静置24h，溶液褪色且清亮透明，于4℃冰箱中避光保存。用前预先取出，使之恢复至室温后再用。如溶液呈粉红色就不能用，须重配。 

标准曲线的制作：准确称取2.686g乙缩醛（CH₃CH(OC₂H₅)₂）用乙酸乙烯酯定容至100ml，配制成10g/l的乙醛溶液。吸取10g/l的乙醛溶液2ml、4ml、6ml、8ml、10ml于5个100ml容量瓶中，用乙酸乙烯酯稀释定容至100ml，配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1g/l的乙醛标准溶液。吸取不同浓度的乙醛标准溶液各50μl于8×12型96微孔板中，加入100μl品红醛，混匀，盖上微孔板盖，于25-50℃显色60-300min，同时做空白，测定吸光度。以吸光度为横坐标，乙醛含量为纵坐标绘制标准曲线。 

比色法测定酶立体选择性的典型过程：准确称取0.01mmol R-醇和0.01mmol相对应的S-醇分别溶于1ml经分子筛除去水分的乙酸乙烯酯中，加入待测脂肪酶10-1500U，加入到5ml具塞塑料管中，200rmp，30-60℃条件下反应4-24小时。取50μl两种构型手性醇的反应液用100μl品红醛在微量比色皿或多孔微孔板中于25-50℃显色60-300min，取水相用比色法于500-540nm处测定吸光度。若吸光值偏高，则将反应液稀释一定浓度后测定。仪器为7230G可见分光光度计，100μl微量比色皿。根据两种立体构型的手性醇反应生成乙醛的量计算对映体过剩量和酶立体选择性。反应生成的乙醛的量（Q_F和Q_S）的计算根据乙醛标准浓度溶液绘制的标准曲线计算。ee_p、ee_s与E值的计算分别按以下公式： 

$\%{\mathrm{ee}}_p=\frac{Q_F-Q_s}{Q_F+Q_s}\times 100\%$$\%{\mathrm{ee}}_s=\frac{Q_F-Q_s}{2Q-Q_F+Q_s}\times 100\%$

$E=\frac{\ln [(1-{\mathrm{ee}}_s)/(1+{\mathrm{ee}}_s/{\mathrm{ee}}_p)]}{\ln [(1+{\mathrm{ee}}_s)/(1+{\mathrm{ee}}_s/{\mathrm{ee}}_p)]}$

Q：投入反应的R-醇或S-醇的量；Q_F：快反应生成的乙醛的量；Q_S：慢反应生成的乙醛的量；ee：对映体过剩量；E：酶立体选择性。 

与本方法对照的产物酯对映体过剩量的测定方法为用气相色谱检测乙酸-R-醇酯和乙酸-S-醇酯的生成量。手性醇的转酯化反应条件同上，转化反应液离心去除酶粉后直接用于气相色谱检测。色谱检测条件为：色谱柱：手性CP-Chirasil-Dex CB石英毛细管柱(25m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度：250℃；FID温度：250℃；升温程序：初始温度60℃，4℃/min升至180℃，保持10min。 

选上述6种脂肪酶，以R/S-1-苯乙醇为底物，乙酸乙烯酯为转酯化反应剂和溶剂，用上述的测定方法进行了验证，结果见表1。气相色谱测得的ee_p值（表1中的方法Ⅱ）和采用比色法测定的结果相关度为90%，说明本发明的测定方法是可行的。 

表1： 

方法Ⅰ：比色法测定转酯化反应4小时的产物对映体过剩量 

方法Ⅱ：气相色谱检测的转酯化反应4小时的产物对映体过剩量。 

本发明测定方法的最佳反应条件与显色条件 

1）转化反应条件 

反应温度：不同脂肪酶对温度的稳定性不同，对于非水相催化反应酶的温度稳定性要远好于水相催化反应。本测定方法在温度30℃-60℃之间对于大多数脂肪酶而言都是有效的。 

底物浓度：酶活测定所需的底物浓度对于不同的酶而言差异很大，分别以脂肪酶PSL、Novozyme435和CAL为例，按上述比色法测定酶立体选择性的典型过程测定，乙醛浓度在0.001-1.5mol/l范围内，用品红醛显色后，吸光度与乙醛浓度成良好的线性关系，因此，应控制底物手性醇的浓度在0.001-1.5mol/l范围内。综合考虑为使该方法对大多脂肪酶具有更好的通用性，采用0.01mol/l的手性醇浓度作为反应浓度。 

2）显色条件 

显色温度：品红醛试剂使用条件的不同，直接会影响该试剂本身的稳定性以及乙醛检测的灵敏度。一般而言，品红醛试剂的使用温度不宜过高，防止试剂因SO₂溢出而失效。分别将10ml品红亚硫酸钠试剂加热至不同温度持续不同时间，观察试剂本身的颜色变化程度。结果说明品红醛试剂在50℃以下更为稳定。 

显色时间：取一定浓度的乙醛乙酸乙烯酯溶液，按上述比色法测定酶立体选择性的典型过程测定吸光度值随显色时间的变化，结果表明显色时间在60-300min内，吸光度随显色时间变化呈线性关系。 

实施例2： 

进行CAL脂肪酶立体选择性的测定 

取2个2ml的具塞塑料管，分别加入10mg CAL脂肪酶和1ml乙酸乙烯酯，然后向一个具塞塑料管中加入10mg的S-1-苯乙醇，另一个具塞塑料管中加入10mg的R-1-苯乙醇，200rmp，40℃条件下反应4h，取50μl反应液用100μl品红醛于25℃显色2h，于520nm处测定吸光度，测得底物对映体过剩量ee_s为95.2%，产物对映体过剩量ee_p为99.3%，酶立体选择性E值为1082.5。 

实施例3： 

立体选择性脂肪酶生产菌筛选 

对于非水相立体选择性脂肪酶生产菌的筛选，采用气相或液相检测需要面对的将是巨大的工作量。从菌种筛选过程中挑选出30株菌，制备成细胞冻干粉，采用脂肪酶催化的无溶剂反应体系，反应后分别采用气相色谱法和本发明方法（实施例1的相同方法）测定酶立体选择性，结果见附图1。结果显示两种测定方法有较高的相关性，相关度达95.6%，表明本发明方法能用于全细胞脂肪酶非水相中立体选择性的测定，并且将该方法用于非水相中高立体选择性脂肪酶的筛选，可大大提高筛选效率。 

实施例4： 

96孔板用于该测定方法的测定，提高测定效率。采用2块8×12型96微孔板进行测定，一块用于转酯化反应，另一块用于显色。取一块96微孔板，于各孔中加入一定量的酶粉和200μl乙酸乙烯酯， 在An-Hn（n=1,3,5,7,9,11）孔中加入0.01mmol R-醇，Am-Hm（m=2,4,6,8,10,12）孔中加入0.01mmol S-醇。反应4-24小时后，用8通道移液器吸取50μl反应液加入到另一块96微孔板相对应的孔中，此时An-Hn（n=1,3,5,7,9,11）孔中为R-醇的反应液，Am-Hm（m=2,4,6,8,10,12）孔中为S-醇的反应液，然后在各孔中分别加入100μl品红醛显色，按上述比色法测定脂肪酶立体选择性的典型过程，于500-540nm处测定吸光度，并计算ee_p、ee_s与E值。