新型分泌蛋白Leg1a和Leg1b在斑马鱼肝脏发育中的功能研究

摘要

肝脏作为脊椎动物体内一个功能重要的实体器官其发育过程相当复杂。肝脏的特化、分化，起始和生长过程是在包括肝脏富集基因在内的一系列时空特异性因子的协同作用下完成的。已有的研究报道显示人们对于肝脏发育过程中涉及的各种分子调控机制还了解得不多。
　　 本实验室先前报道了一个新的功能未知的肝脏富集基因leg1。morpholino介导的基因敲低实验显示该基因的下调导致了肝脏发育变小的表型。为了能够进一步明确该基因在斑马鱼肝脏发育中的作用，本课题深入地分析了lee1在斑马鱼基因组中的结构、定位，leg1表达特征及其在斑马鱼胚胎肝脏发育中的功能，同时还探讨了Leg1敲低引起肝脏变小的分子机制。
　　 基因的结构和定位分析结果显示在斑马鱼基因组中leg1是一个重复基因，存在leg1a和leg1b两个拷贝，它们串联定位在第20号染色体上。leg1a和leg1b序列高度相似，编码的蛋白结构相同，都由N端信号肽和功能未知的DUF781结构域组成通过对基因的表达分析证实在胚胎期leg1a的表达占主导地位(占90％以上)；在成鱼肝脏中leg1a仍为主表达基因，但leg1b表达大幅提高，legb的表达约占40％。本研究通过软件预测结合实验分析证实了Leg1是一个肝脏合成的新型的分泌蛋白，它在斑马鱼肝脏合成后随着血液分布全身。在胚胎肝脏的发育中Leg1a与Leg1b功能都至关重要，它们的功能部分重叠但不完全相同。斑马鱼内胚层器官特异探针的检测结果显示敲低Leg1的表达影响了肝脏的增长而不是肝芽的起始萌发，同时也影响了肠和外分泌胰腺的生长发育。剔除信号肽的截短的Leg1蛋白不能够拯救由MOATG morpholino引起的肝脏变小的表型，证明了信号肽的存在对Leg1的功能至关重要。实验还进一步分析了敲低Leg1表达引起肝脏变小的分子机制，包括通过PH3免疫组化和TUNEL实验分别检测了MOATGmorpholino肝脏细胞的增殖和凋亡情况，结果发现Leg1功能的敲低引起肝脏变小的原因是由于肝脏细胞周期受到了抑制，而跟肝脏细胞的凋亡无关。
　　 此外，本课题通过TILLING的方法，在ENU突变群体中，筛选获得了leg1a基因的两个突变体c11和h11，这为以后剖析Leg1作为分泌蛋白在斑马鱼发育中的生理生化功能，特别是研究它在成鱼中的作用奠定了一定的基础。同时，实验还通过蛋白免疫共沉淀技术在寻找Leg1的互作蛋白方面进行了一些有益的探索。
　　 综合以上，我们推测Leg1很可能代表一类新型胞外信号因子，它在包括肝脏在内的消化器官发育过程中可能扮演着重要角色。今后我们将围绕这个命题开展一系列工作来证明这个推测是否正确，同时也将深入研究Leg1调控肝脏早期发育的分子机制。