甘露聚糖结合凝集素(MBL)阻遏人巨细胞病毒感染MD-DC细胞的研究

摘要

人巨细胞病毒(HCMV)是一种229kb的双链DNA染色体的疱疹病毒科病毒，HCMV感染是儿童常见的感染性疾病。由于HCMV产生的病毒因子逃逸宿主免疫，机体无法彻底清除病毒。目前研究表明，HCMV的复制和感染需要依赖其病毒的包膜糖蛋白，后者在识别宿主细胞膜受体、吸附和穿入宿主细胞、病毒的致病力以及诱导宿主反应等方面起重要作用。HCMV病毒感染细胞的过程是从病毒包膜糖蛋白与靶细胞膜表面受体结合开始的，结合后HCMV以膜融合或受体介导的内吞机制进入细胞。因此，阻遏HCMV糖蛋白与靶细胞膜的结合是控制HCMV感染的重要切入点。
　　 DC细胞表面的特异性细胞间黏附因子3结合非整合素分子(dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin，DC-SIGN)是一种带有外部甘露糖结合位点的C型凝集素结构域的Ⅱ型膜蛋白，能识别多种病原体如病毒、细菌、蠕虫和真菌，在DC细胞识别模式中起重要作用。
　　 天然免疫分子甘露(聚)糖结合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)系C型凝集素超家族成员之一，可与病毒表面多种糖基高效结合组成了机体抗病毒的第一道防线且参与感染进程的调控。目前未见将MBL应用于HCMV感染的研究报道。
　　 本研究研制和纯化重组MBL(rMBL)，从人血浆中纯化出天然MBL(hMBL)，从人外周血单个核细胞中分离培养出高表达DC-SIGN的DC细胞(monocyte-derived dendritic cell，MD-DC)；研究不同浓度的hMBL/rMBL在阻遏MD-DC捕获HCMV，和阻遏HCMV在MD-DC间扩散的功能上的作用差异及时间点，并初步探讨其机制。
　　 方法
　　 1、构建表达人野生型MBL的中国仓鼠卵巢细胞
　　 构建含野生型MBL的pNOW/CMV-A表达载体，参照Ohtanietal方法并加以改进。用上述载体转染CHO细胞株，按Transfast说明书配制转染试剂并进行转染培养的CHO细胞，用G418筛选抗性细胞即稳定转染的细胞，荧光定量PCR分析稳定转染细胞株MBL基因的表达，用ELISA法检测MBL蛋白浓度。
　　 2、rMBL和hMBL的纯化，定量和SDS-PAGE鉴定纯度
　　 CHO/MBL细胞在含20％小牛血清的MEDM培养液中，37℃，5％CO2及饱和湿度条件下培养。取培养上清和人新鲜血浆进行甘露聚糖-Sepharose4B亲和层析纯化。SDS-PAGE鉴定纯度，考马斯亮蓝进行蛋白定量。
　　 3、MD-DC细胞的获得
　　 MD-DC是从人外周血浓缩单个核细胞(PBMC)分离培养而来，rhGM-CSF和rhIL-4刺激培养，第3天半量更换含细胞因子的培养液，第6天收获细胞。
　　 4、MBL阻遏MD-DC细胞捕获HCMV功能
　　 取新收获的，培养第6天的克隆增长的MD-DC，用不同浓度的hMBL/rMBL预处理DC细胞半小时后，再以HCMV感染MD-DC细胞2小时，荧光定量PCR检测MD-DC内HCMV-DNA拷贝数。MD-DC捕获HCMV-DNA拷贝数的百分数(％)=捕获的HCMV-DNA拷贝数/初始加入的HCMV-DNA拷贝数×100。结果经SPSS软件16.0统计学分析。流式细胞术检测MD-DC内HCMV-PP65阳性率(PP65为HCMV的一种特异蛋白，＞2％为阳性，＜0.5％为阴性，0.5％～2％为可疑阳性)。用PKH26红色荧光标记HCMV，用CD209-FITC绿色标记MD-DC细胞表面的DC-SIGN。通过激光共聚焦直接观察DC-SIGN对HCMV的捕获情况，用“imaginj”软件定量分析单位细胞面积内的病毒量，结果经SPSS软件16.0统计学分析。
　　 5、MBL阻遏HCMV在MD-DC细胞间扩散
　　 取新收获的，培养第6天的克隆增长的MD-DC，经HCMV感染2小时后，将MD-DC和不同浓度的hMBL/rMBL共培养3天，在第24小时、第48小时，第72小时用经荧光定量PCR检测MD-DC内HCMV-DNA拷贝数。MD-DC内HCMV-DNA拷贝数的百分数(％)=MD-DC内HCMV-DNA拷贝数/初始加入的HCMV-DNA拷贝数×100。结果经SPSS软件16.0统计学分析。在第72小时用流式细胞术比较MD-DC内HCMV-PP65蛋白阳性率，明确MBL阻遏HCMV在MD-DC间扩散的功能。
　　 结果：
　　 1、稳转细胞目的基因表达效果检测结果：RT-Q-PCR技术，检测稳转细胞目的基因表达效果，筛选得到稳定细胞株中，CHO-MBL目的基因表达是转染空载体细胞株的103倍以上。
　　 2、纯化到大量的NMBL/rMBL：在800ml的CHO/MBL培养上清中，能纯化到447.86ugrMBL；从200ml人血浆中纯化出420.92ughMBL。纯化蛋白电泳：血浆MBL还原电泳可见26KD和32KD两种单体、52KD二聚体、78KD三聚体；血浆MBL非还原电泳均为＞170KD之多聚体；重组MBL还原电泳，可见32KD单体；重组MBL非还原电泳：均为＞170KD之多聚体。
　　 3、MD-DC的培养：人外周血单个核细胞经rhGM-CSF和rhIL-4刺激后，第6天收集MD-DC。光镜下观察MD-DC形态：可见细胞成簇悬浮生长，形态不规则，可见伪足。电镜下MD-DC形态具有典型的树突样特征。用流式细胞仪检测到表达DC的特征性标志：MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40。用抗DC-SIGN的单克隆抗体CD209-FITC流式细胞术检测DC-SIGN百分数达88％。
　　 4、不同浓度的hMBL/rMBL阻遏MD-DC捕获HCMV的作用
　　 荧光定量PCR法检测MD-DC内HCMV-DNA的拷贝数，经统计学分析，与对照组相比，1μg/ml的hMBL组和1μg/mlrMBL组均无显著性差异，而5μg/ml和10μg/ml的hMBL组，5μg/ml和10μg/mlrMBL组均具有显著性差异。各种浓度的hMBL组和rMBL组两两比较均值均偏低，但差异无统计学意义。流式细胞仪检测MD-DC内HCMV-PP65的阳性率，阴性对照组为阳性，10μg/ml浓度的hMBL/rMBL组均为可疑阳性。激光共聚焦技术下经定量检测单位细胞面积内的病毒量，10μg/ml浓度的hMBL/rhMBL具有明显的阻遏MD-DC捕获HCMV的作用。
　　 5、不同浓度的hMBL/rMBL阻遏HCMV在MD-DC间扩散的功能结果
　　 经HCMV感染后的MD-DC和不同浓度的hMBL/rMBL共培养3天，结果经荧光定量PCR检测，与对照组相比，在共培养的第24小时和第48小时各实验组与对照组相比均无显著差异。而在共培养第72小时检测时，1μg/ml的hMBL/rMBL组和对照组相比，结果无显著性差异。5μg/ml和10μg/ml的hMBL/rMBL组与对照组相比均有显著性差异。各种浓度的hMBL组和rMBL组两两比较均值均偏低，但差异无统计学意义。在第72小时用流式细胞术比较细胞内HCMVPP65蛋白阳性率，10μg/ml的hMBL/rMBL孵育组也明显低于对照组。
　　 结论
　　 1、成功建立分泌rMBL细胞株(CHO/rMBL)，获得大量高纯度的rMBL和hMBL；
　　 2、成功从人外周血单个核细胞分离培养出高表达DC-SIGN的MD-DC；
　　 3、MD-DC具有捕获HCMV的功能，HCMV能在MD-DC间扩散；
　　 4、生理浓度的hMBL和rMBL能显著阻遏MD-DC捕获HCMV以及HCMV在MD-DC间的扩散，rMBL效果似较hMBL略差。