黄芪多糖的制备及其对巨噬细胞和树突状细胞免疫功能的影响

摘要

黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)是黄芪的重要生物活性成分之一，具有调节机体免疫功能，抗肿瘤、抗氧化等生物学功能。树突状细胞(dendritic cells，DC)是迄今为止发现的抗原提呈功能最强的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)，在启动T细胞对病原微生物或抗肿瘤的免疫应答中发挥着关键的作用。巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等重要功能。树突状细胞和巨噬细胞在先天性免疫防御和获得性免疫应答中起着重要的作用。
　　 本课题主要分为三个部分进行，第一部分：黄芪饮片粉末经水提，除蛋白、梯度醇沉等步骤获得粗多糖进一步进行凝胶过滤，分步收集洗脱液，利用六种标准分子量的多糖建立了凝胶尺寸排阻色谱法(GPC-SEC-HPLC)检测APS分子量的方法，得到了三个多糖组分，选择平均分子量相对均一、得率、纯度较高的APS(组分Ⅱ，MW6.9×104Da)作为进一步研究的实验材料。
　　 第二部分：研究APS对巨噬细胞功能的影响。用荧光染料2-氨基吖啶酮(2-AMAC)对APS进行荧光标记，激光共聚焦显微镜观察2-AMAC标记的APS(2-AMAC-APS)与RAW264.7巨噬细胞的结合情况。通过Griess法和酶联免疫吸附实验(ELISA)，研究APS对巨噬细胞NO和细胞因子TNF-α，GM-CSF分泌的影响，用LPS的抑制剂多粘菌素B(PMB)来研究制备的APS是否被内毒素污染；Westernblot法研究APS对RAW264.7巨噬细胞核内核转录因子-kappaB(NF-κB)二聚体中p65含量的变化，以及NF-κB抑制剂对APS诱导RAW264.7巨噬细胞产生NO和TNF-α的影响；利用Toll样受体4(TLR4)的抗体研究APS是否参与了对巨噬细胞NO生成的诱导，初步探讨TLR4/NF-κB信号转导通路在APS激活巨噬细胞中的可能作用。
　　 第三部分：通过体外实验研究APS对DC表型和功能的影响，为进一步阐明APS的免疫调节机制提供依据。分四组分别为APS实验组(包括APS和APS-B)、LPS阳性对照组和RPMI-1640培养液阴性对照组，流式细胞仪检测DC表面分子CD11c和MHCⅡ类分子的表达；FITC-dextran用以观察APS、LPS刺激DC后对其吞噬功能的影响；酶联免疫吸附实验检测DC培养上清中白细胞介素-12(IL-12)的含量；扫描电镜观察DC的超微结构。
　　 实验结果显示：MW6.9×104Da的APS重0.952g，糖含量92％；2-AMAC-APS可以时间依赖性的与巨噬细胞结合，未标记的APS能竞争性抑制该结合效应，这与巨噬细胞表面相关受体的饱和程度有关。50,100μg/mlAPS实验组可明显诱导巨噬细胞NO的生成(P＜0.05)。25，50,100μg/mlAPS实验组可促进巨噬细胞TNF-α，GM-CSF的生成，而且呈明显的剂量依赖关系(P＜0.05)。PMB与APS联合使用对巨噬细胞诱导NO生成的影响不显著(P＞0.05)，表明基本可以排除APS受LPS污染的可能性。TLR4抗体能够抑制APS诱导RAW264.7细胞产生NO；Western blot结果显示APS作用于RAW264.7细胞6h，核内p65的含量达到高峰；NF-κB抑制剂PDTC可明显抑制APS对巨噬细胞NO和TNF-α的诱导作用。
　　 APS能够提高DC表面分子CD11c和MHCⅡ的表达，并呈浓度依赖性；空白组DC的吞噬功能很强，LPS阳性对照组DC和APS实验组DC的吞噬功能都明显下降；APS能够促进DC分泌IL-12；电镜观察DC的超微结构，可见APS实验组DC突起增多，形态上更加成熟。
　　 结论：
　　 1.建立了具有自主知识产权的APS分离纯化方法和分子量检测方法，可根据需要得到不同平均分子量的APS。
　　 2.APS能够通过TLR4与巨噬细胞RAW264.7结合，诱导巨噬细胞产生NO、TNF-α和GM-CSF。
　　 3.APS能够诱导DC表面MHCⅡ类分子I-A/I-E的表达，促进细胞因子IL-12的分泌，降低DC的吞噬能力，诱导DC表型和功能的成熟。