传染性法氏囊病病毒VP4蛋白C末端氨基酸残基的功能分析

摘要

属于丝氨酸蛋白酶家族的传染性法氏囊病毒非结构蛋白VP4能利用Ser-Lys催化二联体来实现其蛋白水解功能。本研究为进一步阐释VP4的功能，通过构建突变体分析了C末端残基对蛋白胞内聚合、可溶性与酶解活性的影响。
　　 将IBDV NB、MB和V877毒株的VP4全长、C末端缺失MA氨基酸残基的VP4连接到绿色荧光表达载体pEGFP-C2上，转染DF-1细胞，分析转染细胞中EGFP-VP4的表达分布。结果表明，转染pEGFP-NB-VP4、pEGFP-V877-VP4重组载体的细胞胞浆和核内呈现点状或团块状荧光信号，而转染pEGFP-MB-VP4重组载体的细胞则在胞浆和核内出现针状信号;转染pEGFP-MB-VP4-Δ2aa、pEGFP-NB-VP4-Δ2aa、pEGFP-V877-VP4-Δ2aa重组载体的细胞胞浆和核内呈现弥散状荧光信号，没有明显的点状、团块状或针状荧光信号，这些资料显示不同IBDV毒株VP4蛋白细胞内的点状、团块状或针状形态与其C末端的MA氨基酸残基相关。
　　 将IBDV-NB感染以及pEGFP-VP4、pEGFP-VP4-Δ2aa重组荧光载体转染的DF-1细胞用RIPA裂解液处理后，用SDS-PAGE结合Western blot进行VP4蛋白的可溶性分析。结果表明，在IBDV感染的DF-1细胞内，VP4以可溶和不可溶两种形式存在，但以不可溶形式为主。转染pEGFP-VP4和pEGFP-VP4-Δ2aa的DF-1细胞检测结果与IBDV感染细胞相似，但出现2条分子量约为55KDa的EGFP-VP4特异性条带。与此同时，缺失MA的VP4基因转染细胞上清内的VP4蛋白量高于IBDV感染细胞和VP4转染细胞，说明C末端MA氨基酸涉及VP4蛋白的可溶性。
　　 将构建的VP4 C末端MA缺失A片段重组载体转染细胞后，发现VP4与VP2、VP4与VP3的信号完全一致。构建多聚蛋白VP243重组真核表达载体pCI-neo-A-TNT和pCI-neo-A-ΔMA-TNT，通过体外转录翻译实验分析MA缺失后VP4对多聚蛋白的剪切作用。结果显示，不缺失MA的多聚蛋白基因翻译后能分别检测到VP3和VP4蛋白条带，而MA缺失后只能检测到VP43多聚蛋白条带，说明VP4蛋白C末端的MA残基是VP4蛋白丝氨酸蛋白酶活性的关键位点。

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摘要

缩写词索引

技术路线

第一部分 文献综述

1 传染性法氏囊病病毒的分子生物学研究进展

1．1 IBDV的基本特性

1．2 IBDV的分子生物学特点

1．3 病毒的增殖

1．4 病毒的毒力变异

2 双RNA病毒蛋白酶的研究进展

2．1 VP4蛋白的剪切功能

2．2 VP4剪切功能的影响因素

2．3 VP4蛋白的晶体结构

2．4 VP4蛋白的其它功能

2．5 VP4蛋白的研究方法

第二部分 研究内容

第一章 传染性法氏囊病病毒不同毒株VP4蛋白在细胞中的表达分布

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二章 传染性法氏囊病病毒VP4蛋白C末端MA氨基酸的功能分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文总结

参考文献

附录 常用缓冲液及培养基配方

攻读硕士期间的科研成果

致谢