白菜与黑芥种间异源四倍体的获得及其植物学特性研究

摘要

十字花科芸薹属植物包含A、B、C三个基因组，研究认为，B基因组与A、C基因组的亲缘关系较远，A基因组和C基因组之间的亲缘关系较近。近年来，研究者已成功实现A、C基因组，B、C基因组之间的远缘杂交，但对于A基因组和B基因组之间的亲缘关系和进化理论却少有报道。为进一步深入研究芸薹属植物的远缘杂交，揭示不同基因组间的相互关系和遗传进化理论，本实验以白菜(Brassica rapa，2n=AA=20)和黑芥(Brassica nigra，2n=BB=16)为材料，通过种间远缘杂交获得杂种F1代，并人工诱导杂种F1代染色体加倍，经流式细胞术鉴定，得到异源四倍体(AABB)和非整倍体，为研究芸薹属基因组的进化，基因表达的多态性差异等基础理论研究提供了理想的试验材料。现将研究结果归纳如下:
　　 (1)在白菜与黑芥种间杂交的过程中发现，以白菜作母本的杂交亲和性大于黑芥作为母本时的杂交亲和性。以华南型白菜作母本与黑芥杂交为例，正交的结籽率为5.17％，反交的结籽率仅为0.24％。不同白菜品种与黑芥杂交的亲和性也存在差异，实验发现，华南型白菜与黑芥的杂交亲和性大于桔心红白菜。
　　 (2)建立了白菜与黑芥种间杂交胚拯救技术体系。以华南型白菜×黑芥为例，将授粉后10d-12 d的杂交幼胚接种在MS培养基（含3％蔗糖，0.2％活性炭，400 mg/L谷氨酰胺，2.0 mg/L BA，0.1 mg/L NAA）中的结籽率为24.5％，显著高于其田间自然杂交结籽率5.17％。通过胚培养，有效克服了白菜与黑芥远缘杂交不亲和性。
　　 (3)建立了白菜与黑芥种间杂交异源四倍体诱导体系。本实验通过秋水仙素诱导染色体加倍，获得6株种间杂交异源四倍体和3株非整倍体。结果表明，采用0.2％浓度的秋水仙素溶液浸泡种处理种子8h-16h时，白菜与黑芥杂种能够取得理想的成活率和加倍率。
　　 (4)田间性状调查发现，华南型白菜与黑芥二倍体杂种(AB)性状总体上介于两亲本之间，更偏向于母本，同时存在部分父本性状。如大部分二倍体杂种花期早，易抽薹开花，叶片基部都存在叶耳;但是，杂种S0-21和S0-29的叶片存在表皮毛，而S0-15和S0-34则无叶片表皮毛。异源四倍体植株S0-20和S0-27呈现叶片浓绿宽大，叶柄基部小叶多，茎基部分枝多，冠幅较大，花期晚等性状;非整倍体植株S0-28叶片多褶皱卷曲，叶片浓绿较厚，生长势较弱，花粉败育。
　　 (5)分子鉴定结果表明，杂种后代(S0-3、S0-12、S0-20、S0-21、S0-26、S0-27、S0-28、S0-29、S0-31、S0-33)在RBR基因的两对特异性引物spBr和spBn下进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测均有条带，表明杂种后代同时含有白菜与黑芥染色体基因组信息，为真杂种，结果的真实性得到了ISSR标记的验证。AFLP分子标记对杂种后代与亲本基因表达的多态性初步分析表明，杂种后代与亲本间存在着较为广泛的基因表达差异，AFLP指纹分析出现三种类型的条带，即双亲均没有的新增带、父本特异带和母本缺失带。不同倍性的杂种个体之间三种类型条带所占比例的变化趋势不同。

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致谢

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摘要

1．文献综述及研究的目的意义

1．1 芸薹属远缘杂交概况

1．2 芸薹属植物远缘杂交不亲和性

1．2．1 杂交不亲和性的表现

1．2．2 杂交不亲和性的影响因素

1．2．3 远缘杂交障碍的克服方法

1．3 远缘杂交的意义

1．4 远缘杂种的种类

1．4．1 异源多倍体

1．4．2 异附加系和异代换系

1．4．3 染色体渗入形成的杂种

1．5 远缘杂种的鉴定

1．5．1 形态学鉴定

1．5．2 细胞学鉴定

1．5．3 流式细胞术

1．5．4 分子标记技术

1．5．5 基因组原位杂交技术

1．6 植物多倍化

1．6．1 多倍体的诱导方式

1．6．2 异源多倍体在植物遗传育种改良中的应用

1．7 芸薹属三个基因组间的亲缘进化关系

1．8 本研究的目的和意义

2．白菜与黑芥的种间杂交

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 不同亲本组合正反交结荚率和结籽率的比较

2．2．2 不同培养基对杂交幼胚的培养效果

2．2．3 杂交授粉后不同接种时间的胚培养效果

2．2．4 田间杂交自然结籽率与胚培养的比较

2．3 讨论

2．3．1 芸薹属植物种间远缘杂交亲和性及正反交差异

2．3．2 杂种幼胚培养的影响因素

3．白菜与黑芥种间异源四倍体的合成

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 秋水仙素处理对白菜与黑芥杂种染色体的加倍效果

3．2．2 华南型白菜与黑芥杂种后代的形态学观察

3．2．3 流式细胞倍性分析

3．2．4 杂种育性分析

3．3 讨论

3．3．1 杂种后代与亲本的形态学特征比较

3．3．2 多倍化表型变异的分子机理

4．杂种后代分子特征的初步研究

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 RBR基因鉴定与ISSR

4．2．2 AFLP初步分析

4．3 讨论

4．3．1 RBR基因在进化中的作用

4．3．2 杂种后代基因表达的多态性

5．总结

5．1 白菜与黑芥正反交的亲和性差异

5．2 白菜与黑芥种间杂种胚培养体系的建立

5．3 白菜与黑芥种间杂种多倍体诱导体系的建立

5．4 白菜与黑芥种间杂种后代之间存在表型差异

5．5 RBR基因及ISSR鉴定杂种后代为真杂种

5．6 杂种与亲本之间存在基因表达的多态性差异

5．4 本实验的后续研究工作

5．4．1 杂种S0代的自交及S1代的遗传变异的稳定性

5．4．2 杂种S0代不同个体之间基因表达的多态性

5．4．3 RBR基因在白菜与黑芥杂交世代群体中的表达模式

参考文献