表达传染性法氏囊病病毒非结构蛋白VP5蛋白的DF-1细胞岛的构建

摘要

传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)是鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)的病原体，到目前为止其非结构蛋白VP5参与病毒粒子释放和诱导细胞凋亡的作用机制还未清楚。本研究的目的就在于构建表达强弱毒VP5/DF-1细胞岛，为进行后续VP5功能研究奠定基础。
　　 首先制备VP5多克隆抗体和单克隆抗体，为构建表达VP5的细胞岛提供检测工具。以原核系统表达的VP5蛋白为抗原分别免疫SPF鸡和BALB/C小鼠制备抗VP5蛋白的多抗血清和单克隆抗体。ELISA检测显示制备的鸡抗VP5多抗血清对VP5蛋白具有良好的反应性。间接免疫荧光和Western blot检测证实，鸡抗VP5多抗血清能与IBDV感染和VP5基因转染的细胞发生特异性反应。利用经典的融合技术和有限稀释克隆技术最终获得两株稳定分泌抗VP5蛋白的单克隆抗体细胞株(1D2、2C6)。间接免疫荧光试验和Western blot分析证实，这两株杂交瘤细胞上清既能特异性地结合IBDV感染细胞中的VP5蛋白，也能与转染细胞中瞬时表达的VP5蛋白发生特异性反应。两株单克隆抗体亚类鉴定均为IgG1型，且轻链为κ链。分泌抗VP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞通过连续传代能够保持稳定分泌抗体的能力，染色体核型分析和致肿瘤性实验进一步证明杂交瘤细胞的强抗体分泌能力和生长活性。表位初步分析显示1D2和2C6为识别相同抗原表位的单克隆抗体细胞株，进一步利用合成抗原多肽进行单抗抗原表位鉴定证实1D2和2C6的抗原表位均在VP5-43-69位aa之间。
　　 接着构建表达强弱毒VP5蛋白的重组真核表达载体。以pCI-neo-F38-A，pCI-neo-BF-A重组质粒为模板，PCR扩增VP5基因序列并与pCI-neo、pEGFP-C2真核表达载体连接，成功构建pEGFP-F38-VP5、pCI-neo-BF-VP5△4、pEGFP-BF-VP5△4、pCI-neo-BF-VP5、pEGFP-BF-VP5重组真核表达质粒。IFA检测发现，转染pCI-neo-BF-VP5，pCI-neo-BF-VP5△4，pCI-neo-F38-VP5的DF-1细胞都能够表达VP5蛋白，且VP5蛋白在细胞内分布差异不明显，但是和具有EGFP标签的pEGFP-F38-VP5、pEGFP-BF-VP5△4、pEGFP-BF-VP5重组载体表达的VP5蛋白分布差异明显，说明荧光蛋白的表达使VP5蛋白的分布发生变化，也证明了强毒VP5基因编码N端前四个氨基酸残基的核苷酸序列不影响VP5蛋白的表达。Western-blot分析也能在转染pCI-neo-F38-VP5、pCI-neo-BF-VP5质粒的DF-1细胞中检测到VP5蛋白条带，进一步证明了VP5蛋白在DF-1细胞的表达。用含100μg/mLG418浓度的选择培养基对转染细胞进行筛选，最后获得连续表达VP5蛋白的细胞岛。

目录

声明

论文说明

摘要

第一部分 文献综述

1 传染性法氏囊病病毒的一般生物学特性

2 IBDV的基因组结构

3 IBDV的病毒蛋白及其功能

3．1 VP1蛋白

3．2 VP2蛋白

3．3 VP3蛋白

3．4 VP4蛋白

3．5 VP5蛋白

4 IBDV的抗原与毒力变异

4．1 IBDV的抗原变异

4．2 IBDV的毒力变异

5 IBDV诱导细胞凋亡

1．1 感染IBDV后细胞凋亡的生化特征

1．2 感染IBDV后细胞凋亡的诱因

第二部分 研究内容

第一章 传染性法氏囊病病毒非结构蛋白VP5抗体制备

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二章 表达IBDV VP5蛋白DF-1细胞岛的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文总结

参考文献

附录 常用缓冲液及培养基配方

攻读硕士期间的科研成果

致谢