天然彩色茧丝蚕品种和色素特性研究以及中部丝腺特异性高效表达启动子的初选

摘要

天然彩色茧具有抗氧化、抗菌、不用染色等功能，随着经济的不断发展，用天然彩色茧做成的消费品已经逐步地进入了消费者的日常生活中，所以加强天然彩色茧的品种选育以及对天然彩色茧丝特性的研究具有十分重要的理论与现实意义。
　　 本研究经过对新育成的天然黄色茧品种与生产应用型白色茧品种秋丰×白玉的对比试验发现，秋丰×HJ7正反交、秋丰×黄3正反交这两对黄色茧品种具有龄期短、虫蛹率高、抗病力强的优点;黄色茧品种的产茧量与白色茧品种相差不显著;两对天然黄色茧品种的鲜茧出丝率等茧丝质指标稍低于对照组，解舒率均在65％以上，解舒丝长达到750米左右，净度优良，基本符合缫丝业对茧质的要求。同时对其中的黄色茧品种秋丰×HJ7进行农村大规模化中秋蚕饲养以及缫丝应用试验，结果显示丝质符合生产应用要求。
　　 本研究通过不同蔟具及蔟中环境对天然彩色茧品种秋丰×黄3茧丝质影响等分析得出:在自然通风或封闭的环境中，用方格蔟上蔟时蚕茧的一茧丝长、解舒率、解舒长、清洁度和净度均比蜈蚣蔟好，其中解舒率更是分别提高了6.6％、5％;用方格蔟或蜈蚣蔟上蔟时，在自然通风条件下所得到的茧丝质量要比在封闭环境下高，出丝率分别提高了3.5％、5.2％，解舒率分别提高了11.4％、9.8％，清洁度和净度也有所提高。
　　 本研究通过对几种天然彩色茧烘茧前后色素含量的测定发现:烘茧前，黄酮类含量最高的是绿色茧品种，每克蚕茧达到了2.5mg左右，其次是黄色茧品种，含量也达1mg左右，然后是对照组品种白玉×秋丰，含量最低的是红色茧品种RC;β-胡萝卜素含量较高的是两对黄色茧品种与红色茧品种，其中秋丰×HJ7（正反交平均）、秋丰×黄3（正反交平均）的含量分别为0.501mg/g、0.509mg/g蚕茧，比白色茧品种白玉×秋丰高出了89.195％、89.375％，红色茧RC的含量为0.527mg/g。烘茧后，黄酮类与β-胡萝卜素含量均出现不同程度的降低，其中黄酮类红色茧降低最大，而两个黄色茧品种降低了约20％左右，绿色茧则降低不到10％;β-胡萝卜素含量的变化也因品种而异，其中秋丰×HJ7（正反交平均）比烘前降低了27.485％，含量为0.358mg/g，而秋丰×黄3（正反交平均）烘后β-胡萝卜素含量降低得并不多，降低了9.63％，两对绿色茧品种降低了25个百分点左右;红色茧RC降低了14.58％;白色对照组白玉×秋丰则降低了11.42％，含量为0.048mg/g，含量较低。
　　 本研究通过对几个天然彩色茧品种的蚕茧烘茧前、后的抗氧化物质进行提取与定量分析，研究结果表明:在天然彩色茧中，以绿色茧中的抗氧化活性最高，其次是黄茧，白茧最低。其中烘茧前绿色茧P50×秋丰、LJ13的抗氧化活性均达到230 U/g以上，黄色茧品种秋丰×黄3、秋丰×HJ7抗氧化活性（正反交平均）分别为203.44U/g、192.18 U/g，分别比白色茧品种白玉×秋丰高出52.82％、44.37％;烘茧之后，各品种的抗氧化活性降低的幅度都比较大。
　　 本研究通过对几种天然彩色茧品种蚕茧的抗菌性能进行测定分析表明:天然彩色茧具有非常好的抑菌效果，其中绿色茧品种最高，LJ13、P50×秋丰对金黄色葡萄球菌的抑制率分别达到了83.40％、76.14％，对大肠杆菌的抑制率分别为78.89％、74.4％;两对黄色茧品种蚕茧对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率也均达到了60％以上，都比红色茧和白色茧品种高。
　　 2.家蚕既是理想的模式生物，又是十分重要的经济昆虫，可以利用转基因家蚕表达人类所需用的外源蛋白，但是表达效率较低，其可能的原因是所采用的启动子还没有完全囊括丝蛋白启动子高效表达能力的所有调控元件，所以所采用的启动子还有待进一步改进。
　　 本研究构建了A3启动子驱动EGFP报告基因和ser1-575启动子驱动海参荧光素酶(Rluc)、ser1-2383启动子驱动萤火虫荧光素酶(Fluc)基因的piggybac表达载体pBA3EGFP-ser1-575Rluc-ser1-2383Fluc，利用昆虫卵可视化自吸式外源基因导入法注射到家蚕的早期蚕卵中，通过PCR验证，得知基因已经转入家蚕基因组，为进一步分析启动子元件对外源蛋白表达效率奠定了一定的基础。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 家蚕品种研究现状

1．2 不同蔟具及蔟中环境对蚕茧质量的作用

1．2．1 蔟具

1．2．2 蔟具的主要种类及性能

1．2．3 蔟具与茧质

1．2．4 方格簇的优点

1．2．5 方格蔟的利用现状及原因

1．3 天然彩色茧的色素的研究

1．3．1 天然彩色茧色素的种类及作用

1．4 天然彩色茧的特性及开发前景

1．5 转基因家蚕中部丝腺生物反应器高效表达启动子

1．5．1 转基因家蚕丝腺生物反应器的优点

1．5．2 转座子导入方法

1．5．3 转基因家蚕的检测方法

1．5．4 转基因家蚕的研究现状

1．6 类胡萝卜素结合蛋白

第2章 研究内容与目的

2．1 研究内容

2．2 研究目的

2．3 技术路线

2．3．1 天然彩色茧蚕品种和色素特性研究技术路线

2．3．2 中部丝腺特异性高效表达启动子的构建技术路线

第3章 天然彩色茧新品种的性状调查

3．1 亲本性状特点

3．2 材料与方法

3．2．1 供试蚕品种

3．2．2 实验设计

3．3 结果与分析

3．3．1 实验室养蚕成绩调查与比较

3．3．2 实验室饲养茧丝品质调查

3．3．3 农村饲养成绩调查结果

3．4 小结与讨论

第4章 不同蔟具及蔟中环境对天然彩色茧品种秋丰×黄，茧丝质的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 供试品种与蔟具种类

4．1．2 试验设计

4．2 结果与分析

4．2．1 上蔟期间气象测站与不同蔟室环境温湿度的变化

4．2．2 不同蔟具在相同环境中上蔟对茧丝质影响

4．2．3 在相同蔟具不同环境中上蔟时对丝质的影响

4．2．4 不同蔟具及环境条件对主要茧质指标的影响程度分析

4．3 讨论

第5章 几种天然彩色茧烘茧前后色素含量的测定

5．1 材料与方法

5．1．1 供试品种

5．1．2 主要试剂及仪器

5．1．3 烘茧方法

5．1．4 试样液的制备

5．1．5 黄酮类化合物的测定

5．1．6 β-类胡萝卜素的测定

5．2．结果与分析

5．2．1 黄酮最大吸收波长的确定

5．2．2 芦丁标准曲线的建立

5．2．3 β-胡萝卜素的最大吸收波长的确定

5．2．4 β-胡萝卜素标准曲线的建立

5．2．5 烘茧前后黄酮类化合物的含量及其变化

5．2．6 烘茧前后β-胡萝卜素的含量及其变化

5．3 讨论

第6章 几种天然彩色茧烘茧抗氧化活性的测定与比较

6．1 实验材料

6．2 试验方法

6．2．1 彩色茧样品的准备与试验设计

6．2．2 茧壳内抗氧化物质的提取

6．2．3 标准超氧化物歧化酶(SOD)抑制曲线的建立

6．2．4 提取液抗氧化物活性测定

6．3 结果与分析

6．3．1 SOD标准抑制曲线的绘制

6．3．2 不同颜色的蚕茧烘茧前、后抗氧化性的测定

6．4 小结与讨论

第7章 几种天然彩色茧抑菌率的测定与比较

7．1 实验材料

7．2 实验方法

7．2．1 试样茧洗涤程序

7．2．2 试样的准备

7．2．3 接种菌液的制备

7．2．4 接种菌液的准备

7．2．5 实验操作方法

7．2．6 抑菌率

7．3 结果

7．3．1 天然彩色茧对金黄色葡萄球菌的抑制率

7．3．2 天然彩色茧对大肠杆菌抑制率

7．4 小结与讨论

第8章 转基因家蚕Ser-1高效表达启动子的构建

8．1 实验材料

8．1．1 家蚕品种、菌种和质粒

8．1．2 工具酶及试剂用品

8．1．3 主要实验仪器

8．2 实验方法

8．2．1 感受态细胞大量制备

8．2．2 转化

8．2．3 质粒DNA抽提

8．2．4 DNA的酶切反应体系

8．2．5 DNA连接反应体系

8．2．6 目的片段的分离与回收

8．2．7 PCR扩增目的片段混合液

8．2．8 PCR扩增反应循环条件

8．2．9 琼脂糖凝胶电泳

8．3 转基因载体pBser1-575R1uc-ser1-2383F1uc-A3-EGFP的构建

8．3．1 搜寻启动子序列

8．3．2 显微注射

8．4 结果与分析

8．4．1 转基因载体pBA3EGFP-ser1-575R1uc-ser1-2383F1uc的鉴定

8．4．2 转基因家蚕的获得

8．5 讨论

总结及问题

参考文献

附录

致谢