基于dsRNA的烟草和番茄抗双生病毒基因工程研究

摘要

双生病毒(geminiviruses)引起的病害在世界范围内广泛发生，在我国其引起的番茄曲叶病发生面积大、发展迅速、危害严重。但是目前我国对该类病害还缺乏有效的控制策略。RNA沉默是近年发现的植物对病毒的自然抗性机制，利用RNA沉默技术进行植物抗双生病毒基因工程研究，有望获得广谱高抗的转基因植物，为有效控制这类病毒病害奠定基础。
　　 本文利用RNA干扰技术进行番茄和普通烟抗双生病毒基因工程研究，以在植物体内转录出RNA沉默的高效诱导因子dsRNA为目标，将引起我国番茄曲叶病害的3种主要双生病毒番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellow leaf curl virus，TYLCV)、台湾番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Taiwan virus，ToLCTWV)和中国番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV)的部分复制酶基因以反向重复的方式与拟南芥内含子相连，并定向插入到植物表达载体pBIN438上35S启动子下游;以农杆菌介导法转化番茄和烟草。目前获得阳性转基因烟草，并对这种转基因烟草进行了抗病性测定。用TYLCV接种47株TO代阳性转基因烟草，症状观察和TAS-ELISA检测表明，不同TO代转基因烟草对TYLCV的抗性程度不同。转化番茄实验正在进行中.为了能更好的控制番茄曲叶病害的发生，本实验同时对TYLCV的部分rep基因构建反向重复植物表达载体并转化普通烟和番茄，目前已获得阳性转SH2hp-rep普通烟TO代27株，对TYLCV的抗性正在测定中.番茄转化还在进行中.
　　 另外，本文利用滚环扩增（RCA技术在云南采集的89个样品中，发现一种与云南烟草曲叶病毒（Tobacco leaf curl Yunnan virus，TbLCYnV）伴随的重组缺陷型小分子.该小分子大小为754bp，含有大多数nanoviruses中保守的九核苷酸TAGTATTAC和TYLCCNV卫星betasatellite的卫星保守区的互补序列，不编码蛋白。致病性测定实验发现，该重组缺陷型小分子可与辅助病毒一起复制，推迟本氏烟发病，但对症状和病毒积累量无很大影响。推测该分子是双生病毒进化过程中的一个中间产物.

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 Begomovirus研究进展

1．1．1 Begomovirus的基因组结构与功能

1．1．2 Begomovirus伴随的DNA卫星

1．1．3 Begomovirus的危害及重要性

1．2 RNA沉默

1．2．1 RNA沉默的概念

1．2．2 RNA沉默途径的基本机制

1．2．3 植物中的RNA沉默途径

1．2．4 RNA沉默在植物中的应用

1．3 抗双生病毒病基因工程研究进展

1．3．1 表达病毒的蛋白或蛋白突变体进行抗双生病毒基因工程

1．3．2 表达非病毒蛋白进行抗双生病毒基因工程

1．3．3 表达病毒干扰型DNA进行抗双生病毒基因工程

1．3．4 利用RNA干扰机制进行抗双生病毒基因工程

1．4 研究的目的与意义

第二章 dsRNA介导的普通烟和番茄抗双生病毒基因工程

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 分子实验方法

2．1．3 反向重复植物表达载体的构建

2．1．4 普通烟转化与卡那霉素抗性植株的再生

2．1．5 番茄转化与与卡那霉素抗性植株的再生

2．1．6 转基因烟草阳性植株检测

2．1．7 转Zhhp普通烟对TYLCV-[CN：SH2]的抗性分析

2．2 结果与分析

2．2．1 TYLCV、ToLCTWV和TYLCCNV融合片段的克隆和反向重复植物表达载体的构建

2．2．2 TYLCV-SH2部分rep基因片段的克隆和反向重复植物表达载体的构建

2．2．3 烟草叶盘的基因转化和植株的形成

2．2．4 番茄叶盘的基因转化和植株的形成

2．2．5 转ZHhp普通烟植株的PCR检测

2．2．6 转SH2hp-rep普通烟植株的PCR检测

2．2．7 转ZHhp普通烟接种TYLCV及抗性分析

2．3 讨论

第三章 云南烟草曲叶病毒伴随的缺陷型重组小分子

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 DNA分子操作常规技术

3．1．3 伴随卫星分子的检测

3．1．4 伴随卫星分子侵染性克隆的构建

3．1．5 伴随卫星分子侵染性克隆导入农杆菌

3．1．6 农杆菌接种和致病性测定

3．2 结果与分析

3．2．1 RecsatDNA分子的检测

3．2．2 RecsatDNA分子的序列分析

3．2．3 RecsatDNA侵染性克隆的获得

3．2．4 RecsatDNA侵染性克隆的致病性分析

3．3 讨论

参考文献

附录A：常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器

附录B：常用缓冲液及培养基配方

在学期间所取得的科研成果