小分子化合物邻位连接检测技术研究

摘要

对生物小分子物质如添加剂、兽药等进行快速而有效的监测有着直接而现实的意义。本实验运用邻位连接实验并对其进行了改良，创新性地发明了竞争性免疫磁珠亲和检测试验(Competitive Immunomagnetic-Proximity Ligation Assay，CIPLA)，用来对生物小分子物质进行定量监测，取得了良好效果。
　　 在本实验中，我们选取了瘦肉精中的克伦特罗(Clenbuterol，CLE)和莱克多巴胺(Ractopamine，RAC)作为CIPLA检测的模式分子。瘦肉精最初是作为一种药物在临床上用来治疗呼吸系统疾病的。但随后发现其具有能量重分配作用，可以加强脂肪分解，促进蛋白质合成，进而增加猪的瘦肉率，改善肉的品质，产生更大的经济效益。但瘦肉精代谢缓慢，长期食用会在动物及人的组织内蓄积，当其在人体内的积累量超过人体的毒性反应剂量时就极易引发食物中毒。因此对瘦肉精残留的及时精确检测具有重大的现实意义。传统的检测小分子化合物的方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、高效液相色谱技术(HPLC)、免疫PCR等方法，但是由于它们灵敏度不高或特异性不好等原因，当生物组织中的小分子添加剂含量低至一定阈值后就难以检测出来，因此发展更加灵敏的生物小分子痕量检测方法就显得极为必要。
　　 CIPLA技术在小分子化合物的痕量检测方面满足了上述要求。将竞争性结合机制与邻位连接试验相结合，依赖特异的亲和探针之间产生的邻位效应，仅仅使用一个单克隆抗体就能对小分子进行快速而精确的检测。CIPLA技术克服了由于小分子特殊的空间结构而产生的空间位阻效应，首次实现了将邻位连接试验运用于生物小分子的检测。
　　 在实验中，我们分别运用抗原核酸和抗体核酸两种探针对瘦肉精进行了检测。通过对实验条件的不断优化，对克伦特罗和莱克多巴胺均检测了5个不同数量级的小分子浓度，最低检测限均可达到0.01 ng/ml，是EIJSA检测的10-50倍，表明了本方法极高的灵敏度和良好的动态检测范围。CIPLA技术可行性高，适用范围广，能够运用到更多种类的小分子物质的痕量检测中，具有重要的理论及实践意义。