胚胎后肾间充质干细胞分化为上皮细胞的关键因子和Notch信号通路的初步研究

摘要

肾脏疾病已经成为威胁人类健康的第三大主要疾病。急性损伤、严重创伤后患者易发生多器官功能衰竭，据统计，其死亡率高达45％[1]。研究显示严重创伤、严重感染和强应激状态下可以引起患者体内细胞因子的瀑布样释放，呈现级联放大作用。肾脏在应激和炎症反应中起重要作用，多器官功能障碍患者，一旦肾脏受累则预后明显不良，由于超负荷的细胞因子释放，多种应激信号通路的过度开放，肾脏作为最容易被打击的器官首先发生衰竭症状，激化全身各脏器功能衰竭，导致患者死亡[2]。持续性肾脏替代治疗(CRRT)作为最主要的治疗方法，其昂贵的治疗费用，和治疗功能的局限，以及疾病本身的凶险多变，使得治愈率一直在50％左右[1]。在对肾脏发育及固有细胞分化机制明确研究的基础上，发展应用细胞疗法修复肾脏损伤，将成为急性肾损伤治疗的一大重点和难点。为解决急性肾脏损伤的诊治引入新的技术方案，具有重要的社会意义和科学意义。
　　 另一方面，全球有10％的患者罹受慢性肾脏疾病困扰，其中又有10％的患者进展为慢性肾功能不全[3]。患病率高，医疗费用巨大，预后差，并且患者人数呈持续增长趋势，造成了严重的社会经济负担。由于慢性肾脏病病因复杂多样，发病机制尚未完全明了，对于慢性肾病的治疗仅局限于对症支持治疗而没有取得突破性的进展。肾移植是目前治疗终末期肾病(ESRD)最好方案。我国约有100万慢性肾功能不全患者，每年新增12万人，每年约有50万患者需要肾移植[4]。然而每年全国可供移植的肾源仅有4000个，有的病人只能一边做血透，一边等待，不仅费用巨大，以每个患者每年5万元的透析费用计算，我国每年花费在血液透析上的医疗费用高达250亿元人民币[4]。而且许多人因为长期等不到供体，病情加重，最后丧失了移植的良机。肾移植随着近年来移植免疫研究的不断深入和新型免疫抑制剂的不断问世，急性排异发生率显著下降，一年移植物的存活率得到了明显的提高，但其长期生存情况仍不乐观，十年长期存活率目前只有50％-61％左右。目前直接针对肾脏疾病本身的研究，在发病机制和治疗上均无突破性进展，而又有研究表明人类三分之一的慢性肾脏疾病与肾脏发育紊乱相关。因而从肾脏胚胎发育着手，研究肾脏正常发育的分子机制和信号通路，为阐明肾脏疾病的发生发展机制，提出新的干预治疗修复策略已成为肾病领域的又一研究重点。
　　 本课题旨在研究后肾向肾脏固有细胞分化过程，明确期间起重要作用的Notch信号通路，阐明其信号传导通路和分子机制。目的是为将来能够修复肾脏损伤和体外构建或克隆培育一个可供移植的肾脏奠定理论和实验基础。
　　 第一部分小鼠胚肾发育过程中Notch信号通路关键基因筛选
　　 目的：严密观察胚胎后肾间充质向肾脏固有细胞分化过程，利用高通量基因芯片(Notchsignalingpathway)方法，筛选相关候选基因，即关键信号，进一步探索肾小管胚胎发育过程中起关键作用的信号分子及分子调控机制，为阐明肾脏疾病的发生发展机制，为将来能够修复肾脏损伤和体外构建或克隆培育一个可供移植的肾脏奠定理论和实验基础。
　　 方法：
　　 1.采用清洁级健康雌性小鼠BALB/c，雄性小鼠BALB/c，体重均为18～23g。将雌雄小鼠同笼受孕。在孕10.5天、孕12.5天、孕14.5天、孕16.5天和孕18.5天处死孕鼠，并获取各孕期的小鼠胚胎肾脏组织进行HE染色，严密观察胚胎后肾间充质向肾脏固有细胞分化过程。
　　 2.获取孕12.5天、孕14.5天、孕16.5天和孕18.5天的小鼠胚胎肾脏组织，以高通量基因芯片(Notchsignalingpathway)方法，OligoGEArray基因芯片筛选相关候选基因，即关键信号。针对芯片原始数据利用MultiClassDif工具进行各分组间的差异基因筛选；筛选出的差异表达基因利用GeneFunNet工具构建基因的功能关联网络，根据基因的功能属性，计算目标基因间属性距离，根据属性关系确定基因间作用方向，以此构建基因-基因网络，然后计算出各基因的网络特征值，确定网络中枢性调控基因。着重研究在胚胎肾脏发育起决定作用的时间段逗形期到S形期，也是肾脏固有细胞生成的重要时期，Notch信号通路的重要作用，有助于我们锁定候选基因。
　　 结果：通过对获取的各孕期小鼠胚胎肾脏组织，进行HE染色，观察并验证了胚胎后肾间充质向肾脏固有细胞分化过程，同时验证了获取的胚肾组织各孕期的正确性。通过高通量基因芯片(Notchsignalingpathway)方法，OligoGEArray基因芯片筛选相关候选基因，得到三种表达趋势变化的差异性表达基因。即E12.5、E14.5天表达量逐渐增加，到E16.5天表达量达到高峰，而E18.5天表达减少的基因ADAM10、MFNG；E12.5-18.5表达量逐渐增加的基因Pparg；E12.5-18.5天表达量逐渐减少的基因Ccnel。
　　 结论：利用高通量基因芯片(Notchsignalingpathway)方法，进一步探索肾小管胚胎发育过程中起关键作用的信号分子及分子调控机制，筛选获得在胚胎肾脏发育逗形期到S形期起决定作用的时间段，也是肾脏固有细胞生成的重要时期2个特异性基因ADAM10、MFNG。
　　 第二部分小鼠胚胎后肾间充质干细胞体外分化中Notch信号通路关键基因的作用
　　 目的：
　　 1.从基因和蛋白质水平分别验证利用高通量基因芯片(Notchsignalingpathway)方法筛选获得的相关候选基因在小鼠胚胎后肾间充质干细胞体外分化中Notch信号通路的作用。
　　 2.使用ADAM10特异性抑制剂G1254023X拮抗金属蛋白酶的作用，阻断Notch信号通路，观察其对胚胎后肾间充质干细胞向肾脏固有细胞分化的抑制作用。
　　 方法：
　　 1.采用清洁级健康雌性小鼠BALB/c，雄性小鼠BALB/c，体重均为18～23g。将BALB/c雌性小鼠与BALB/c雄性小鼠同笼受孕。在12.5天、14.5天、16.5天和18.5天数处死孕鼠，并取各孕期的小鼠胚胎肾脏组织。
　　 2.提取各孕期的小鼠胚胎肾脏组织的蛋白质，使用Westernblot方法从蛋白质水平验证利用高通量基因芯片(Notchsignalingpathway)方法筛选获得的相关候选基因在小鼠胚胎肾脏组织的表达量。提取各孕期的小鼠胚胎肾脏组织的总RNA，使用RT-PCR方法从基因水平验证基因芯片筛选获得的相关候选基因在小鼠胚胎肾脏组织的表达量。从而进一步证明筛选获得的相关候选基因在小鼠胚胎后肾间充质干细胞体外分化中Notch信号通路的重要作用。
　　 3.分离培养原代E14.5天胚胎后肾间充质干细胞，使用ADAM10特异性抑制剂G1254023X拮抗金属蛋白酶的作用，阻断Notch信号通路，抑制胚胎后肾间充质干细胞向肾脏固有细胞分化过程。并通过细胞免疫组化观察检测间充质干细胞表达标志物Pax-2、WT1，上皮细胞标志物E-cadherin、Cytokeratin8染色情况。
　　 结果：通过RT-PCR方法从基因水平、Westernblot方法从蛋白质水平分别验证了ADAM10、MFNG基因E12.5、E14.5天表达量逐渐增加，到E16.5天表达量达到高峰，而E18.5天表达减少。分离培养原代E14.5天胚胎后肾间充质干细胞，ADAM10特异性抑制实验，细胞免疫组化：间充质干细胞表达标志物Pax-2、WT1阳性率药物组较对照组低，上皮细胞标志物E-cadherin、Cytokeratin8阳性率药物组较对照组低。
　　 结论：
　　 1.荧光定量RT-PCR检测结果显示小鼠胚胎肾脏发育的各时期，均能检测到肾脏发育关键因子ADAM10、MFNG基因的表达。
　　 2.WesternBlot检测结果显示小鼠胚胎肾脏发育的各时期，均能检测到肾脏发育关键因子ADAM10、MFNG基因的蛋白表达。
　　 3.通过从基因及蛋白水平上验证，利用高通量基因芯片(Notchsignalingpathway)方法获得ADAM10、MFNG这两个基因在小鼠胚胎后肾间充质干细胞分化中的重要作用及其变化趋势。
　　 4.使用体外ADAM10特异性抑制剂G1254023X拮抗金属蛋白酶作用，可有效的阻断Notch信号通路，抑制胚胎后肾间充质干细胞向肾脏固有细胞分化过程。验证了逗形期到S形期是胚胎肾脏发育起决定作用的时间段，也是肾脏固有细胞生成的重要时期。
　　 第三部分药物干扰Notch信号通路对小鼠胚胎肾脏发育的影响
　　 目的：评价有机磷农药毒死蜱对胚胎肾脏发育的影响，并评估Notch2-Jagged1信号通路在此过程的重要作用
　　 方法：妊娠7.5-11.5天的母鼠予以连续皮下注射毒死蜱5mg/kg/day(6只)，对照组(6只)注射生理盐水。于妊娠16.5天处死母鼠，取胚胎肾脏组织、心脏组织、肝脏组织于福尔马林固定，石蜡包埋切片。组织切片脏染色观察两组胚胎肾脏组织、心脏组织、肝脏组织形态学不同，并采用ABC法免疫组化鉴定两组胚胎肾脏、心脏组织、肝脏组织Notch2、Jagged1的表达情况。
　　 结果：
　　 1.正常小鼠胚胎肾脏在E16.5天时已形成S形体，并发育成具有肾单位并可能开始分泌尿液的原肾。HE染色发现CPF药物处理组，胚胎肾脏发育明显迟缓，E16.5天时没有出现S形体和肾单位。两组胚胎肝脏均出现熟的肝细胞及成形的肝内胆管，两组组织形体学上未见到明显异常。两组胚胎心脏均已完成腔室分化、房室瓣形成，心肌细胞分化增殖使心壁致密变厚，两组HE染色组织形体学上未见到明显异常。
　　 2.免疫组化染色显示正常妊娠16.5天的胚胎肾Notch2-Jagged1信号通路中的Notch2、Jagged1抗体表达也明显比毒死蜱处理组强。两组胚胎心脏、胚胎肝脏Notch2、Jagged1抗体均为阴性染色。
　　 结论
　　 1.毒死蜱特异性影响了胚胎肾发育过程中的Notch2-Jagged1信号通路。
　　 2.Notch2-Jagged1的信号通路在S形体向原肾脏发育过程中起重要作用。