基因工程菌E.coli pET28a(+)-PAW的构建及其转化废弃物产生物柴油的研究

摘要

近年来，生物柴油作为一种可再生，无毒可降解的新能源，逐渐成为了人们的研究热点。它是由油酸、亚油酸等长链饱和或不饱和脂肪酸，同甲醇或乙醇形成的脂肪酸甲酯(fatty acid methyl esters，FAMEs)或脂肪酸乙酯(fatty acid ethyl esters，FAEEs)类化合物。现在世界上95％的生物柴油原料来自动植物油脂，使得生物柴油的价格是石化柴油的1.5倍，寻求新的廉价易得的原料降低生物柴油的成本是形势所趋。利用微生物合成生物柴油的方法与工业化生产生物柴油的化学催化法相比，不仅在生产过程中更加清洁无环境污染，而且可以通过对微生物进行基因工程改造，使其合成更符合人类需要的生物柴油成分。因此，利用基因工程菌发酵生产生物柴油具有重要的现实意义。
　　 本文的主要研究结果如下：
　　 (1)产生物柴油的基因工程菌构建
　　 利用基因工程手段，从Zymomonas mobilis中扩增得到丙酮酸脱羧酶(pyruvatedecarboxylase，pdc)和乙醇脱氢酶(alcohol dehydeogenaseⅡ，adh)两个基因，从Acinetobacter baylyi ADP1(BD413)中扩增得到蜡酯合成酶/二酰基甘油转移酶(waxester synthase/acyl-coenzyme A：diacylglycerol acyltransferase，atfA)基因。利用重叠延伸PCR技术扩增获得含有pdc和adh两个基因的可以产乙醇的片段PA，和含有PA和atfA基因的片段PAW。在融合基因PA的引物设计中，通过去除pdc片段末端的TAA终止密码子，使pdc和adh两个基因共用一个T7启动子，并在pdc和adh两个基因中间加入一段Linker，使形成的融合蛋白PA能够正确折叠，保证PA融合蛋白具有自身的催化活性。PAW蛋白中的两个基因各自带有一个T7启动子。经相关的分子克隆技术，成功获得工程菌E.coli pET28a(+)-PAW。经SDS-PAGE凝胶电泳分析和酶活测定，证明该工程菌可以有效表达外源蛋白。
　　 (2)工程菌发酵生产生物柴油的条件探究
　　 将工程菌E.coli pET28a(+)-PAW接入含有外源脂肪酸和糖类的LB发酵培养基中，能产生乙醇和多种脂肪酸乙酯。结果显示，培养基中的添加木糖有利于工程菌细胞内生物柴油脂滴的积累，添加葡萄糖有利于工程菌发酵生产乙醇。当发酵培养基中添加2％葡萄糖时，得到最大乙醇含量8.12 g1-1和1.81 g1-1脂肪酸乙酯，脂肪酸乙酯占细胞干重的62％。当发酵培养基中添加2％木糖时，共得到3.73 g1-1乙醇和最大脂肪酸乙酯含量2.79 g1-1，脂肪酸乙酯占细胞干重的82.2％，透射电子显微镜可清晰观察到菌体细胞内形成的脂滴。
　　 (3)工程菌利用餐饮泔水生产生物柴油的研究
　　 以餐饮泔水为脂肪酸替代物，工程菌能利用餐饮泔水产生生物柴油。当餐饮泔水中不添加任何糖类物质发酵生产生物柴油时，FAEEs的含量最低，为0.047 g1-1，乙醇的产量为1.05 g1-1。当单独添加2％的木糖至泔水培养基中时，得到最大脂肪酸乙酯的含量0.249 g1-1。木糖有利于菌体积累脂肪酸乙酯，这一结果与在LB培养基中的发现一致。通过Pearson相关性分析，发现乙醇产量与基质中糖量呈正相关(R=0.844，p=0.017)。同时通过三个非线性回归方程表明葡萄糖浓度不仅比木糖更利于糖的利用，也利于乙醇的生产，木糖有利于脂肪酸乙酯的生产。GC/MS分析显示餐饮泔水中大部分的脂肪酸经工程菌发酵后转化得到相应的酯化物，所得到的生物柴油的冷滤点在-5℃到-10℃之间，性能较好，能够在低温环境中应用。
　　 (4)工程菌利用秸秆水解液生产生物柴油的研究
　　 三种不同秸秆成分的分析显示，玉米中纤维素含量最高(49.20％)，其次为水稻(46.64％)、小麦(44.13％)；三种秸秆中半纤维素含量从大到小依次为玉米(20.92％)、小麦(20.74％)、水稻(17.08％)。秸秆水解液的HPLC分析表明玉米水解液中葡萄糖含量(10.40 g1-1)大于水稻(7.93 g1-1)和小麦水解液的葡萄糖含量(4.55 g1-1)；小麦水解液中木糖含量(40.56 g1-1)依次大于玉米(37.15 g1-1)和水稻水解液中木糖含量(31.23 g1-1)。当工程菌E.coli pET28a(+)-PAW以小麦，玉米和水稻三种秸秆的水解液为糖类替代物发酵生产生物柴油时，小麦水解液培养基中合成的生物柴油量(0.30g1-1)高于玉米水解液培养基中的含量(0.25 g1-1)和水稻水解液培养中的含量(0.19g1-1)。小麦水解液培养基较另外两种水解液更适合发酵生产生物柴油。