新型P2Y样G蛋白偶联受体GPR17在缺血性脑损伤中的作用

摘要

研究背景：
　　 脑缺血再灌注损伤是高度复杂的病理过程，脑缺血诱导的神经元损伤和小胶质细胞炎症是脑缺血后病变的主要特点。小胶质细胞是脑内主要的炎症细胞，小胶质细胞的激活对于缺血后炎症进程以及慢性神经功能的恢复具有重要的影响。腺嘌呤核苷酸(ATP、ADP)、尿嘧啶核苷酸(UTP、UDP)、糖基化核苷酸(UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖)等细胞外核苷酸以及半胱氨酰白三烯(cysteinylleukotrienes，CysLTs，包括LTC4、LTD4和LTE4)是两类重要的细胞外信号分子，能够交叉调节中枢神经系统的炎症，其中包括脑缺血。
　　 GPR17原是一种G蛋白偶联的孤儿受体(orphanreceptor)，在2006年被鉴定出来，在分子进化上与P2Y核苷酸受体和半胱氨酰白三烯受体均有交叉，是一种新型P2Y样受体。GPR17是一个“二元受体”，半胱氨酰白三烯(LTC4、LTD4)及尿嘧啶核苷酸(UDP、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖)均能激活GPR17；但GPR17是否能归类在白三烯受体，目前还不够成熟。
　　 GPR17主要分布在脑内，其次为肾脏、心脏和血管内皮细胞，目前对GPR17的效应了解较少，正常时GPR17表达在脑、脊髓神经元和少突胶质细胞的前体细胞，星形胶质细胞不表达GPR17。GPR17能够调节中枢神经系统少突胶质前体细胞的发育成熟，是髓鞘形成的细胞内计时器。GPR17是脑和脊髓损伤的感受器，免疫染色结果显示损伤急性期GPR17表达升高，而用反义寡核苷酸手段敲低GPR17的表达能够控制急性永久性脑缺血损伤以及脊髓损伤的进展；然而，因缺乏GPR17选择性拮抗剂和动物特异性抗体，GPR17是否参与脑缺血后神经元损伤、小胶质细胞的激活，以及是否对慢性脑缺血损伤也具有调节作用，尚待阐明。
　　 研究目的：
　　 本文拟观察新型P2Y样G蛋白偶联受体GPR17对脑缺血诱导的神经元损伤及小胶质细胞激活的影响，做以下2个方面的研究：
　　 (1)观察大鼠局灶性脑缺血后脑内GPR17的时空表达特征及细胞定位，并干扰脑内GPR17表达，观察对脑缺血急、慢性期神经元损伤和小胶质细胞激活的影响；
　　 (2)以RNA干扰技术，研究GPR17对OGD诱导的皮层细胞混合培养中神经元损伤和小胶质细胞激活的影响。
　　 研究方法：
　　 以线栓法制备大鼠局灶性脑缺血(MCAO)模型。采用免疫组织化学、免疫印迹、RT-PCR等方法，观察脑内GPR17表达的时空特点，免疫荧光双染观察受体在脑内的分布。大鼠侧脑室埋管，注射GPR17siRNA，靶向沉默脑内GPR17表达，观察对大鼠局灶性脑缺血急、慢性期神经元损伤和小胶质细胞激活的影响。
　　 在大鼠皮层细胞混合培养体系中，以缺氧缺糖(OGD)诱导缺血性损伤，以GPR17siRNA靶向沉默混合培养体系中GPR17的表达，观察对OGD诱导的原代皮层细胞混合培养体系中神经元损伤和小胶质细胞激活的影响。
　　 研究结果：
　　 第一部分大鼠局灶性脑缺血后脑内新型P2Y样G蛋白偶联受体GPR17表达增加介导神经元损伤和小胶质细胞激活
　　 大鼠MCAO后缺血中心区，GPR17蛋白在缺血再灌注12、24h和7、14d表达上调；缺血周边区，再灌注3d内GPR17蛋白表达变化不大，而在再灌注7、14d明显增高。与Westernblot结果相一致，RT-PCR的结果显示在缺血后中心区，GPR17mRNA在缺血再灌注24h和7、14d表达上调；缺血周边区，再灌注24h、3、14d明显增高。免疫组织化学结果显示GPR17阳性细胞数在缺血后中心区和周边区增多。免疫荧光结果显示，正常大鼠脑组织中，GPR17主要表达于神经元、少突胶质细胞，室管膜细胞。MCAO后，在缺血中心区，再灌注24h后GPR17主要表达于损伤的神经元，少量表达于损伤的小胶质细胞和少突胶质细胞，再灌注14dGPR17主要表达于增生激活的小胶质细胞，部分表达于少突胶质细胞；在缺血周边区，再灌注24h后GPR17主要表达于神经元，少量表达于小胶质细胞和少突胶质细胞，再灌注14d后GPR17主要表达于神经元、部分增生的小胶质细胞和少突胶质细胞。星形胶质细胞不表达GPR17。
　　 经Westernblot及免疫荧光染色证实，大鼠侧脑室给予GPR17siRNA成功抑制缺血后脑内GPR17表达。GPR17siRNA给药后能显著减轻缺血再灌注24h神经症状、减少脑梗死体积以及改善缺血中心区的神经元缺失；同样，它也改善缺血再灌注14d脑萎缩和缺血周边区的神经元缺失，还显著抑制小胶质细胞的增生激活。
　　 这些结果证实，缺血后脑内GPR17表达上调，介导脑缺血后急性期神经元损伤和亚急性/慢性期小胶质细胞增生和炎症。
　　 第二部分GPR17干扰对OGD诱导的皮层细胞混合培养中神经元损伤和小胶质细胞激活的影响
　　 大鼠原代皮层细胞混合培养中，经Westernblot及免疫荧光染色证实，GPR17siRNA成功抑制GPR17表达。OGD/R(OGD1h恢复24h)诱导细胞活性下降，LDH释放增加，PI染色结果显示细胞坏死增加。GPR17siRNA抑制OGD/R诱导的LDH释放，提高细胞活性，并减少细胞坏死数目。并且，免疫荧光双染结果显示，细胞死亡以神经元死亡为主，少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞死亡较少，GPR17siRNA主要减少神经元死亡。免疫荧光染色结果还显示，GPR17siRNA能够抑制小胶质细胞激活的形态变化。免疫荧光以及Westernblot结果显示，敲低GPR17表达后CysLT1受体表达增加。
　　 上述结果提示，GPR17介导皮层细胞混合培养中OGD诱导的神经元损伤和小胶质细胞激活。并且，GPR17与CysLT1受体亚型之间可能存在着相互调节。
　　 结论：
　　 1.在大鼠局灶性脑缺血后，脑内GPR17表达的时空分布特点以及GPR17siRNA干扰的结果表明，缺血后脑内GPR17表达上调，介导缺血后急性神经元损伤以及亚急性/慢性期的小胶质细胞激活。
　　 2.在大鼠皮层细胞混合培养中，GPR17RNA干扰的结果表明，GPR17介导OGD诱导的神经元损伤和小胶质细胞激活。干扰GPR17表达可上调CysLT1受体表达，提示两种受体亚型之间存在着相互调节，可能共同参与调节细胞功能。