万寿菊中叶黄素的化学性质、定量分析及其制品安全性研究

摘要

万寿菊花瓣橙黄色，富含叶黄素，广泛应用于饲料行业，以改善动物品质。同时，叶黄素活性成分具有预防白内障、降低老年性视黄斑退化风险以及提高人体免疫力等生理功能，广泛应用于医药食品行业。本文以万寿菊中叶黄素为研究对象，对提取物的指纹谱图、稳定性、酯水解技术、分析方法、以及农药和重金属残留的安全性评价等方面进行系统研究，主要研究结果如下：
　　 (1)采用薄层色谱法从万寿菊中分离类胡萝}、素，结合光谱数据、色谱保留时间并与文献数据进行比较，得到含5种类胡萝卜素、6种叶黄素二酯和3种叶黄素单酯的混合标准品，并建立万寿菊正己烷萃取液的液相色谱特征指纹谱图。通过对万寿菊花瓣、万寿菊粉末、万寿菊颗粒、添加叶黄素的饲料、添加叶黄素的配方奶粉和叶黄素软胶囊的色谱特征成分分析比较研究，万寿菊的特征成分为叶黄素二酯(包括6种化合物)，该色谱峰高呈正态分布，可作为万寿菊或者万寿菊萃取物及强化产品的特征峰。研究结果还表明万寿菊的新鲜花瓣和万寿菊干粉中很少存在游离叶黄素、顺式叶黄素和叶黄素单酯，在添加叶黄素的食品或者饲料中则存在顺式叶黄素和叶黄素单酯。
　　 (2)研究了叶黄素在不同的pH值、温度、空气中的稳定性以及在不同有机溶剂中的降解规律。结果表明，叶黄素在弱酸、中性和弱碱环境中稳定。在低于80℃的温度条件下，叶黄素对热有较好的耐受性，添加抗氧化剂和氮气保护，能提高叶黄素的储存期。在有机溶剂中叶黄素的降解符合热力学方程。在二氯甲烷溶剂中生成两个顺式叶黄素，其总量符合降解动力学：在乙醇溶液中顺式叶黄素总量的降解不符合任何降解动力学方程；在乙酸乙酯溶液中，9(9’)顺式+13(13’)-顺式叶黄素含量的降解动力学符合二次曲线方程，但是两者的降解趋势与在二氯甲烷溶液中的降解趋势不同。该结果表明，不同溶剂体系对光激发催化叶黄素共轭双键的反应机理是不相同的。
　　 (3)对叶黄素酯的热水解条件进行了优化，采用异丙醇代替毒性较大的苯作为溶剂热回流水解，选择反应温度、反应时间、碱浓度和有机溶剂四个因素进行正交组合，确定了叶黄素水解收率最高的优化水平组合。同时，对冷皂化和超声波水解叶黄素酯进行初步试验研究，表明这两种方法都很难快速、完全地水解叶黄素酯。同时，对微波水解叶黄素酯的离解和异构化机理进行探讨，结果表明微波能快速水解叶黄素酯，很少产生异构化中间体，且微波水解能缩短分析时间，减少溶剂用量，符合绿色化学的发展趋势。
　　 (4)研究比较了几种叶黄素的测定方法。对AOAC分光光度法测定叶黄素总量的方法进行改进，用异丙醇代替毒性大的苯，同时减少净化步骤，可以不使用叶黄素或者苏丹红Ⅰ标准品；用分光光度计测定吸光度值，利用比尔-朗伯定理简单计算叶黄素酯含量；比较叶黄素和叶黄素酯总量的吸光度值，两者有好的相关性，叶黄素酯吸光度值比叶黄素吸光度值高8％。研究HPLC法测定叶黄素含量的标准方法(NY/T2008-2011)，通过加标回收率实验、日内精密度、日间精密度、人员比对重复性实验和实验室间的再现性试验，根据GB/T6379.2-2004《测试方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》要求的数据统计分析，对方法的精密度(重复性和再现性)进行验证，结果符合国家标准的要求，说明该方法有好的适用性和可操作性。首次采用UPLC技术成功分离叶黄素和玉米黄质，在3min内能完全分离叶黄素和玉米黄质。相比HPLC法，UPLC对玉米黄质的分离度提高2倍。HPLC进样10μL叶黄素的灵敏度与UPLC进样1μL的灵敏度是一样的，但是在UPLC条件下，对玉米黄质的灵敏度能提高1倍。将两种方法对20个万寿菊样品中叶黄素和玉米黄质含量测定的结果进行比较，通过T-检验分析，表明两种方法测定结果是一致的。
　　 (5)万寿菊及其制品中有害物质残留分析及其安全性评价。设计组装分子蒸馏和吸收装置，用来测定万寿菊中二硫代氨基甲酸酯的农药残留总量。组装两台独立泵和温度控制器、构建碱水解的衍生化装置，用于万寿菊中7种氨基甲酸酯残留的测定。研究三氟乙酸酐与农药阿维菌素的乙酰化反应，提出衍生化反应的新机理，氮甲基咪唑先与三氟乙酸酐反应，然后与阿维菌素上羟基结合产生荧光物质，能减少中间产物，提高衍生化产物的稳定性。将以上分析方法用于测定万寿菊中51种农药残留水平和安全性，结果表明万寿菊中农药检出率高，特别是检出甲胺磷等禁用农药，需要制定相应的规范种植要求(GAP)。采用一次微波消解万寿菊样品，分别以原子荧光光度计测定砷、汞和原子吸收光度计测定铅、镉，结果表明万寿菊中砷和镉存在超标的风险。
　　 本文研究了万寿菊中叶黄素的化学性质、光降解规律、微波加热水解叶黄素酯、定量测定方法以及农药、重金属的限量分析和安全性评估，为万寿菊的精深加工提供理论和技术支撑。同时，制定了农业行业标准《NYIT2008-2011万寿菊及制品中叶黄素的测定高效液相色法》。该行业标准的制定与实施，为万寿菊系列产品的质量控制和贸易合格评定奠定了基础。可有效地引导万寿菊产业向优质安全的方向发展，以增强其制品在国内外市场的竞争力。