产普那霉素始旋链霉菌发酵的代谢调控、条件优化及软测量建模研究

摘要

普那霉素是由始旋链霉菌产生的链阳性菌素类抗生素，由普那霉素Ⅰ和普那霉素Ⅱ两类化合物组成，对包括耐药菌在内的大多数革兰氏阳性菌均具有较强的杀菌活性，且抗生素后效应较长，因此被公认为是治疗顽固性革兰氏阳性菌感染的首选药物。本文以提高普那霉素发酵产量及其优化控制为目标，对培养基组分在普那霉素生物合成的调控机理、溶氧及合成前体对其生物合成的影响开展了较系统的研究，并探索利用支持向量机模型建立发酵过程重要参数的预测模型。主要结果摘要如下:
　　 培养基关键组分对普那霉素生物合成的调控机理分析首先就培养基中葡萄糖、铵离子及磷酸盐等组分对普那霉素生物合成的调控机理进行研究，发现高浓度的葡萄糖、磷酸盐及铵离子可抑制普那霉素的合成。当葡萄糖浓度、磷酸盐和铵离子浓度分别高于30g/L、1.5 mM及15 mM时，普那霉素的合成量大大降低。进一步研究显示，葡萄糖和磷酸盐主要通过糖的磷酸化以及葡萄糖-6-磷酸的积累反馈而抑制糖分解代谢，从而抑制普那霉素的生物合成;而铵离子则通过抑制糖酵解(EMP)途径和己糖—磷酸途径（HMP），激活三羧酸循环关键酶，起到对普那霉素生物合成的调控作用。
　　 添加氧载体对普那霉素生物合成的影响考察了在摇瓶中添加氧载体或乳化氧载体对普那霉素发酵的影响。加入适量氧载体或乳化氧载体有利于改善发酵液中的氧传递，使得菌丝体生长良好，普那霉素产量明显高于对照组。在发酵36h时添加10％经0.01％二甲基硅油乳化的正十六烷，普那霉素的产量达到180.6 mg/L，为对照组产量的3.1倍。同时考察了菌丝体形态和普那霉素生物合成的关系，添加乳化氧载体后，菌丝团较疏松，有利于氧和营养物质的传递，似为普那霉素产量提高的主要原因。
　　 基于普那霉素生物合成途径的发酵条件优化以已知的生物合成途径为切入点，研究进一步提高普那霉素产量的发酵优化策略。结果表明，在发酵培养基中加入0.2％的正丙醇，普那霉素产量比对照提高135.2％。此外，评价了氨基酸前体对普那霉素发酵的影响，由此建立了以甘氨酸作为最佳前体在摇瓶发酵的优化添加策略。继之，利用3L发酵罐进行了耦合树脂原位吸附分离的扩大发酵试验，在发酵36 h时添加0.75 g/L甘氨酸，并在20 h时添加树脂进行原位分离，此时普那霉素的最高产量可达到616 mg/L，分别为仅添加甘氨酸、树脂及对照处理的1.7、2.8及4.3倍，这一结果表明，添加甘氨酸耦合树脂的原位吸附分离是提高始旋链霉菌F213发酵生产普那霉素产量的有效途径。
　　 基于支持向量机的发酵过程软测量建模生物发酵过程通常具有机理复杂性、高度非线性及生物参数难以在线实时测量的特点，在成功利用支持向量机理论建立植物乳杆菌的菌体浓度v-SVR软测量模型的基础上，对普那霉素发酵产量及菌体浓度建立了v-SVR预测模型，结果表明，利用支持向量机理论建立的产物浓度及菌体浓度软测量模型拟合误差小，推广性能好，可作为发酵过程优化控制的参考依据。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

1 普那霉素的研究、生产及应用概况

1．1 普那霉素概述

1．1．1 普那霉素的理化性质

1．1．2 普那霉素的作用机制

1．1．3 普那霉素的抗性机制

1．1．4 普那霉素的抗菌活性

1．1．5 普那霉素的临床应用

1．2 普那霉素的生物合成和调控机理研究

1．2．1 普那霉素Ⅰ的生物合成

1．2．2 普那霉素Ⅱ的生物合成

1．2．3 抗生素生物合成的营养代谢调控

1．3 抗生素发酵过程的优化策略

1．3．1 前体对产物生物合成的作用

1．3．2 氧载体对产物生物合成的影响

1．4 微生物发酵过程软测量研究现状

1．5 本文研究内容与思路

2 培养基关键组分对普那霉素生物合成调控机理分析

2．1 材料和方法

2．1．1 菌株

2．1．2 培养基

2．1．3 培养方法

2．1．4 菌体核酸量测定

2．1．5 普那霉素测定

2．1．6 丙酮酸含量测定

2．1．7 琥珀酸脱氢酶活力测定

2．1．8 ATP含量测定

2．1．9 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力的测定

2．1．10 葡萄糖6-磷酸的测定

2．1．11 还原糖含量的测定

2．1．12 铵离子含量的测定

2．1．13 溶磷(无机磷)含量的测定

2．2 结果与讨论

2．2．1 葡萄糖对普那霉素生物合成的代谢调控

2．2．2 铵离子对普那霉素生物合成的代谢调控

2．2．3 磷酸盐对普那霉素生物合成的代谢调控

2．3 小结

3 添加氧载体对普那霉素生物合成的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株、培养基及培养条件

3．1．2 菌体干重与普那霉素测定

3．1．3 氧载体筛选

3．2 结果与讨论

3．2．1 不同氧载体对普那霉素产量的影响

3．2．2 氧载体添加时间与浓度对普那霉素发酵产量的影响

3．2．3 乳化正十六烷氧载体对普那霉素发酵的影响

3．4．4 乳化正十六烷作为氧载体对菌丝分布状况的影响

3．3 小结

4 基于普那霉素生物合成途径的发酵优化研究

4．1 材料和方法

4．1．1 菌株与培养基

4．1．2 培养方法

4．1．3 发酵罐扩大培养

4．1．4 样品分析方法

4．2 结果与讨论

4．2．1 短链脂肪酸、醇对普那霉素合成的影响

4．2．2 普那霉素发酵的氨基酸前体筛选及添加策略优化

4．2．3 添加甘氨酸柄合原位分离的普那霉素3L罐发酵

4．3 小结

5 基于支持向量机的发酵过程建模

5．1 支持向量机基础理论

5．1．1 SVM回归估计理论

5．1．2 v-SVR模型参数的确定

5．1．3 模型评价指标

5．2 基于支持向量机的发酵过程软测量建模

5．2．1 基于支持向量机和遗传算法的植物乳杆菌发酵建模

5．3．2 基于v-SVR的普那霉素发酵过程建模

5．3 小结

6 结语

参考文献

附：在读期间己发表的研究论文