小G蛋白Rab6和Ran在对虾和果蝇细胞吞噬及抗病毒中的作用

摘要

细胞吞噬是宿主消化病原的直接途径，是生物体最古老、最基本的防卫机制之一，它是先天性免疫系统的重要组成部分。无论是单细胞动物还是多细胞动物，都是通过吞噬活动保持自身稳定和对外防御。吞噬是一个动态过程，肌动蛋白（actin）在空间聚合上的变化为细胞吞噬提供了动力，肌动蛋白骨架的变化影响吞噬的整个过程。肌动蛋白高度有序的聚合，依靠其他因子的调控，目前只发现小G蛋白Rho可以影响骨架蛋白聚合。本实验室前期研究发现，小G蛋白Ran和Rab6可以通过调节骨架蛋白进而调控吞噬，但是具体机制不清楚。在前期研究基础上，本论文进一步研究Rab6和Ran调控细胞吞噬及其抗病毒的分子机理。
　　 由于对虾没有细胞系，所以在体内研究目的蛋白的过量表达比较困难。质粒转入对虾活体，除了具有导入质粒的困难，质粒本身启动子的结构、质粒的稳定性、mRNA的结构都会影响蛋白的表达。体外合成mRNA，不仅成本较高，而且mRNA及其不稳定，容易降解。为了找到一种合适的对虾体内蛋白过量表达的方法，我们采取体外重组表达绿色荧光蛋白(GFP)，纯化透析后注射进入对虾体内。结果显示，GFP能有效进入对虾血细胞内，分布于细胞质中。该方法的建立为研究对虾及其病毒的蛋白质的功能奠定了基础。
　　 本文研究结果显示，在对虾中，Rab6蛋白通过和肌动蛋白直接互作，影响肌动蛋白骨架的构象，进而调控细胞吞噬，抵抗对虾白斑综合症病毒(WSSV)的侵染。在对虾中，当Rab6基因的表达被序列特异的siRNA抑制后，肌动蛋白的构象发生明显变化，细胞骨架蛋白actin由片层状变成伪足状，并且细胞吞噬病毒的活性显著下降，吞噬病毒的速率降低，表明Rab6蛋白通过影响actin蛋白的构象调控细胞吞噬。本文采用果蝇S2细胞进行研究，发现Rab6蛋白对细胞吞噬的调控机制与对虾中的结果相同。结果表明，在S2细胞中，当Rab6基因被序列特异的siRNA抑制表达后，细胞内肌动蛋白的聚合程度明显下降;Rab6基因过表达后，肌动蛋白聚合程度提高;在S2细胞中拯救Rab6基因表达时，细胞骨架形态也恢复正常。上述结果说明，Rab6蛋白对肌动蛋白的聚合起非常重要的作用。有效的吞噬包括颗粒摄取和吞噬体的成熟过程，吞噬过程可分为趋化、吸附、吞入和消化杀菌四个阶段。为了探讨Rab6调控吞噬的具体阶段，在果蝇S2细胞中，我们将Rab6蛋白和早期溶酶体标志蛋白(Rab5)、晚期溶酶体标志蛋白（LAMP）相比较，发现Rab6影响整个吞噬过程。结果表明，无论是颗粒摄取还是消化处理时期，无论是吞噬前期还是吞噬后期，Rab6基因被抑制后，细胞吞噬百分率及酸化百分率都显著下降。结果证明，Rab6影响肌动蛋白的构像，从而调控细胞吞噬的整个过程。将对虾的Rab6序列进行同源比较，结果显示对虾的Rab6和果蝇、人类的Rab6分别具有88％和91％的同源性，且在结构域活性位点上很保守，说明在进化中，无论是脊椎动物还是无脊椎动物，Rab6基因很保守。因此，本文揭示的Rab6调控无脊椎动物细胞吞噬的机制在动物界中可能是普遍存在的一条简单高效的吞噬调控方式，这为研究先天性免疫分子机制在脊椎动物中扩大了视野，我们的研究为小G蛋白调控吞噬提供了新证据。
　　 广泛的证据表明病毒的结构蛋白在病毒感染中起重要作用，但是关于宿主和病毒之间的蛋白互作研究很少。本实验室在前期研究中发现，WSSV病毒的VP466蛋白和宿主的Rab6蛋白、原肌球蛋白(tropomyosin)、肌动蛋白形成蛋白复合体。本文进一步研究揭示VP466是双功能蛋白，可以介导两条信号通路，一条是VP466通过与tropomyosin的互作有利于病毒复制，一条是宿主Rab6蛋白与VP466互作后有利于宿主抗病毒免疫，且两条通路最后的效应蛋白都是肌动蛋白。在VP466-Rab6-actin信号通路中，VP466是Rab6的GTPase激活蛋白，Rab6活性的提高导致actin聚合的加强，有利于细胞吞噬活性的增强。在VP466-tropomyosin-actin信号通路中，原肌球蛋白引导肌动蛋白变化，actin被病毒利用，有利于病毒自身的感染和装配。研究结果表明，宿主Rab6蛋白和原肌球蛋白都结合在VP466上的同一个区域(301-340)，所以WSSV病毒VP466蛋白介导的两条通路实际上是一种竞争关系。越来越多的证据表明多功能蛋白存在于病原中，但是病毒中的多功能蛋白很少见。因此，我们的研究揭示了病毒多功能蛋白的存在，并且病毒蛋白可以竞争性被病毒本身或宿主利用，启动两条不同的通路，阐述了一种关于无脊椎动物病毒与宿主之间互作的新机制。
　　 Ran蛋白之前在对虾体内发现调控吞噬，但是具体过程不清楚。为了阐明其调控机理，我们以无脊椎动物模式生物果蝇S2细胞为研究对象，开展相关研究。本文研究发现，在果蝇S2细胞吞噬其病毒DCV过程中，Ran基因上调表达，暗示Ran蛋白可能参与果蝇抗病毒感染的先天性免疫。结果表明，当Ran基因表达被抑制时，细胞的吞噬活性显著下降;当Ran基因过表达时，细胞的吞噬活性明显上升。当吞噬标志性蛋白Rab5、LAMP和Ran基因表达被抑制后，无论在吞噬摄取颗粒时期还是消化处理时期，抑制Ran表达的细胞其吞噬百分率一直最低。以上结果表明，Ran蛋白参与调控果蝇细胞的吞噬过程，进而抵御病毒对宿主的侵染。我们的研究对于了解目前仍然知之不多的与细胞核有关的小G蛋白参与细胞吞噬过程的调控有奠定了一定的基础。

目录

声明

摘要

引言

1．1 无脊椎动物的先天性免疫

1．1．1 基于体液的免疫

1．1．2 基于细胞的免疫

1．1．3 对虾免疫系统

1．2 吞噬

1．2．1 吞噬体形成

1．2．2 吞噬体成熟过程

1．2．3 吞噬与抗病毒

1．2．4 吞噬研究方法

1．3 吞噬与小G蛋白

1．3．1 小G蛋白分类

1．3．2 Rab家族蛋白及其相关研究

1．3．3 小G蛋白Ran及其相关研究

1．4 本论文研究的目的及意义

材料与方法

2．1 材料

2．1．1 试验用动物、细胞、菌株和质粒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 引物

2．1．4 主要仪器设备

2．1．5 常用溶液和培养基

2．2 方法

结果与分析

3．1 蛋白质导入对虾体内方法的建立

3．1．1 GFP蛋白的克隆表达及纯化

3．1．2 GFP蛋白在对虾血细胞中的定位分析

3．2 小G蛋白Rab6调控细胞吞噬的机制

3．2．1 Rab6蛋白同源性比较

3．2．2 Rab6对吞噬的调控机制

3．2．3 WSSV病毒膜蛋白VP466与对虾Rab6和tropomyosin蛋白的互作分析

3．3 小G蛋白Ran在吞噬中的调控作用

3．3．1 果蝇S2细胞Ran基因的重组表达和纯化

3．3．2 果蝇S2细胞Ran重组蛋白的抗体制备

3．3．3 Ran基因在果蝇S2细胞中的表达

3．3．4 细胞内检测吞噬过程中的Ran基因的表达

3．3．5 Ran对吞噬活性的影响

3．3．6 Ran基因抑制后影响细胞的吞噬

讨论

小结与展望

参考文献

附录

致谢