环介导等温扩增技术快速检测水产动物病原的研究

摘要

随着水产养殖规模的扩大和养殖环境的恶化，水产动物的病害越发严重，成为制约水产养殖业健康发展的瓶颈因素之一。水产病原的快速诊断，对水产养殖的良种选育，疾病预防、进出口检疫、水产品食品安全等方面具有重大意义。由于各自的缺陷，常规的病原检测技术大都不适合养殖基层的现场快速检测。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)是一种新的DNA扩增方法。该技术依赖于自动循环的链置换反应，通过识别靶序列上6个特异区域的引物和具有链置换的DNA聚合酶，在等温条件下，不到1h就能扩增出109靶序列拷贝，具有特异、灵敏、快速、简便等特点，适合于养殖基层的现场快速检测。
　　 本研究新建了环介导等温扩增方法分别快速检测对虾白斑综合征病毒、皮下及造血组织坏死病毒和弧菌。首次进行了白斑综合征病毒和皮下及造血组织坏死病毒进行同时检测的研究，以及首次对某一类特定病原体进行通用LAMP检测研究，研究了LAMP对弧菌属细菌的通用性检测。设计不同病原相应的检测引物，分别对其反应条件（镁离子浓度、甜菜碱浓度、反应时间、反应温度等）进行了优化，并检测了其特异性及灵敏度。首次将dUTP-UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）技术引入LAMP检测中，克服了LAMP反应极易产生假阳性的缺点，并对dUTP对dTTP的替代率、替代对反应灵敏度的影响进行了研究。并将建立好的LAMP检测方法用于实际水产动物样品的病原检测。具体结论如下:
　　 1、优化后的白斑综合征病毒LAMP反应体系在64℃下45 min即能有理想扩增效果。加入SYBR GreenⅠ后，能用肉眼进行结果的判断。使用常见细菌和对虾病毒做对照，显示LAMP反应对WSSV检测具有很好的特异性。灵敏度达到100 copies/μl，比巢式PCR高100倍。反应中使用dUTP替代部分dTTP，结合UNG酶，可以避免LAMP的产物遗留污染的问题，但替代率高于50％后，显著抑制反应的扩增效率。在对虾样品的WSSV检测中，LAMP方法表现出比巢式PCR更好的检测灵敏度和更快速的检测流程。
　　 2、皮下及造血组织坏死病毒LAMP反应体系在65℃反应60 min完成扩增反应。产物经荧光染色后发生颜色变化，产物检测方便。对扩增产物进行酶切得到与预期相吻合的片段。50％的dUTP替代和UNG酶的使用能避免假阳性的发生，但会使反应灵敏度下降10倍。LAMP反应对IHHNV具有较好的特异性。其LAMP灵敏度较普通PCR高1000倍。对实际对虾样品的IHHNV检测中，LAMP方法于PCR方法结果一致，但表现出更高的效率和更加直观准确的结果。
　　 3、优化后的WSSV和IHHNV多重LAMP反应体系需在65℃反应60 min。产物经过酶切得到的与预期大小相吻合的条带。多重LAMP具有较好的特异性和较高的灵敏度，比巢式PCR高两个数量级，较普通PCR高三个数量级。在实际对虾样品的检测中，多重LAMP检测较PCR检测具有更高的病毒检出率和更高的检测效率。
　　 4、优化后的弧菌属细菌通用LAMP检测的反应体系需在62℃反应60 min。通用LAMP检测对弧菌属细菌具有高度的特异性。检测灵敏度较普通PCR方法高100倍。将通用LAMP检测方法应用于人工感染弧菌的水产动物检测上，表现了很好的检测效果。
　　 检验结果表明，LAMP检测方法是一种操作简单、灵敏度和特异性较高的快速检测手段;无需特殊仪器设备，非常适合基层养殖场和防疫部门开展实地检测，同时也适合开发为快速检测试剂盒，在水产病原的实地快速高诊断方面具有重大的开发潜力。

目录

声明

资助项目

摘要

主要英文缩写与译名

第一部分 文献综述

第一章 水产病害的检测技术

1．1 主要水产病原

1．2 水产病原的检测和鉴定

参考文献

第二章 环介导等温扩增技术及其应用

2．1 LAMP方法的基本原理

2．2 LAMP产物检测

2．3 LAMP的特点

2．5 LAMP技术的发展

2．6 LAMP技术的应用

参考文献

第二部分 研究内容

第三章 白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 小结

参考文献

第四章 LAMP快速检测对虾IHHNV的方法与应用

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 小结

参考文献

第五章 多重环介导等温扩增技术快速同时检测WSSV及IHHNV

5．1 材料与方法

5．2 结果

5．3 小结

参考文献

第六章 环介导等温扩增技术快速通用检测水产动物弧菌方法的建立

6．1 主要实验仪器

6．2 结果

6．3 小结

参考文献

第三部分 总结与展望

第七章 总结与展望

7．1 主要结论

7．2 主要创新点

7．3 不足和展望

第四部分 附录

攻读博士期间的科研成果

致谢