蛙抗菌肽Palustrin-OG1的分子改良及改良肽的生物学活性、抗菌机制和重组表达研究

摘要

Palustrin-OG1(OG1)是来源于无指盘臭蛙Odorrana grahami皮肤分泌物的含31个氨基酸残基的阳离子抗菌肽。本课题组前期研究结果表明:OG1的抗菌活性高于乳源抗菌肽，但具有较高的溶血率。因此，本研究对OG1进行了分子改良，比较了OG1及改良肽OG2、OG2N、OG2A及OG2W的抗菌活性和细胞毒性。在此基础上研究了OG1及其改良肽OG2和OG2N的杀菌机制，最后利用大肠杆菌及酵母表达系统表达了改良肽OG2。主要研究结果如下:
　　 1 OG1的分子改良及改良肽的筛选
　　 蛋白序列比对及氨基酸保守性分析结果表明:OG1属于Brevinin抗菌肽超家族，具有C端保守的Cys及典型的Rana box结构。圆二色谱结果表明:OG1为α螺旋肽。在使用CCS模型分析OG1理化性质的基础上，通过删减和替换氨基酸、去除二硫键、提高两亲性和净正电荷、降低疏水性等策略对OG1进行分子改良，获得了4个改良肽OG2、OG2N、OG2A和OG2W，其中OG2、OG2N及OG2A为α螺旋肽，OG2W为β折叠肽。CCS模型分析结果表明:与模板肽OG1相比，4个改良肽的两亲性及净正电荷都有所提高，而疏水性大大降低。抗菌活性测定结果表明:与模板肽OG1相比，4个改良肽对有害菌的抗菌活性都有所提高，其中改良肽OG2和OG2N对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及绿脓杆菌的抗菌活性是OG1的1～16倍;此外，与模板肽OG1相比，改良肽OG2和OG2N对有益菌枯草芽孢杆菌的抗菌活性分别降低了32倍和8倍。细胞毒性测定结果表明:与模板肽OG1相比，改良肽OG2和OG2N对猪红细胞及外周血单个核细胞的细胞毒性显著降低(p＜0.05)，而改良肽OG2A和OG2W仍具有较高的细胞毒性。综合分析OG1及其改良肽的理化性质及生物学活性，结果表明:疏水性的降低是OG2和OG2N细胞毒性较低的主要因素，而净正电荷及两亲性的增加是OG2和OG2N抗菌活性较高的主要因素。
　　 2 OG1及改良肽OG2和OG2N的抗菌机制研究
　　 使用透射电镜观察OG1及改良肽OG2、OG2N对金黄色葡萄球菌细胞形态的影响，结果表明:1×MIC（Minimal inhibitory concentration，最小抑菌浓度）时，OG1处理后的细菌细胞壁和细胞膜变形破损、内容物泄漏，OG2处理后的细菌出现空泡化，OG2N作用效果与OG1类似;3×MIC各处理组细菌全部裂解，说明OG1及改良肽OG2和OG2N对细胞膜都具有破坏作用。大肠杆菌的透射电镜观察结果表明:1×MIC各处理组大肠杆菌严重空泡化、细胞质区域电子密度大幅降低。
　　 通过SYTOX摄取试验研究了OG1及改良肽OG2、OG2N对细菌细胞膜通透性的影响，结果表明:与模板肽OG1相比，OG2和OG2N对细菌细胞膜通透性的破坏作用有所降低，但对细菌细胞膜仍有较强的破坏作用。综合分析OG1及其改良肽OG2和OG2N的细胞毒性及膜作用机制，提示:与模板肽OG1相反，改良肽OG2和OG2N对细胞膜通透性的破坏具有选择性。
　　 使用DNA结合试验和无细胞蛋白合成抑制试验研究了OG1及改良肽OG2、OG2N可能存在的胞内作用机制。结果表明:与模板肽OG1相比，改良肽OG2及OG2N对pGEM-3Z质粒的结合能力增强，但三者对蛋白的合成都没有抑制作用。提示:改良肽可能对胞内DNA的复制有影响，但对DNA的转录、翻译以及蛋白的生物学活性可能无影响，即改良肽OG2和OG2N主要通过破坏细菌细胞膜发挥抗菌作用。
　　 3改良肽OG2在大肠杆菌中的表达、分离纯化及活性测定
　　 鉴于大肠杆菌是畜禽生产中的主要致病菌，而改良肽OG2对大肠杆菌K88的抗菌活性是OG2N的2倍，且OG2对枯草芽孢杆菌的抗菌活性低于OG2N，在细胞毒性方面与OG2N无显著差异，因此对改良肽OG2进行了重组表达。
　　 首先，研究了四个分子伴侣包括硫氧还蛋白Trx、内含肽Synechocystis sp DnaB（intein1）和Mycobacterium xenopi GyrA(intein2)以及类泛素调节蛋白SUMO对OG2表达的影响。结果表明:四个融合蛋白均在大肠杆菌中成功表达，其中Trx、intein1和intein2在提高融合蛋白可溶性方面效果较好，可溶性融合蛋白的表达量依次为50、44及24.5 mg/L。
　　 其次，研究了肠激酶(EK)及烟草蚀刻病毒蛋白酶（TEV酶）对Trx融合蛋白切割效率的影响。通过Ni-NTA亲和层析、Sephadex G25脱盐及超滤浓缩获得了纯度大于85％的融合蛋白，酶切结果表明:当EK识别位点紧靠OG2的N端时，Trx-EK-OG2无法被EK切割;当EK与OG2间插入TEV酶切位点，Trx-TEV-OG2在EK切割4h或TEV酶切割16h后达100％裂解。抑菌试验结果表明:EK和TEV酶切割Trx-TEV-OG24 h后的产物对金黄色普通球菌具有明显抑菌活性，但TEV切割后释放的OG2容易降解，而EK切割释放的OG2在N端增加了额外氨基酸。
　　 最后，研究了intein对OG2在大肠杆菌中表达、纯化的影响。通过对OG2进行C端融合及N端融合，成功表达了融合蛋白OG2-intein2-CBD及CBD-intein1-OG2。通过将IPTG诱导浓度从0.5 mM降至0.1 mM、诱导温度从37℃降至30℃，可溶性OG2-intein2-CBD占总目的蛋白的含量从30％左右提高到70％，表达量提高到75 mg/L，融合蛋白总表达量达107.1 mg/L，OG2表达量达8.9 mg/L; CBD-intein-OG2在0.1 mM IPTG20℃诱导6h后，约42％的融合蛋白为可溶蛋白，提示:诱导剂浓度及诱导温度的降低有效提高了融合蛋白的可溶表达。通过Chitin亲和层析、DTT在柱切割及Sephadex G10脱盐成功纯化得到了OG2，DTT切割效率达85％以上，且OG2对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌具有抑菌活性。CBD-intein-OG2融合蛋白的切割试验结果表明:OG2的N端Lys抑制了融合蛋白的裂解。因此，intein2是在大肠杆菌中表达OG2的最佳分子伴侣。
　　 4改良肽OG2在酵母的表达、分离纯化及活性测定
　　 首先，利用巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）分泌表达了OG2及PS-OG2。通过密码子优化及SOE-PCR获得了OG2(38％GC)、OG2O(44％GC)及PS-OG2(50％GC)。使用宿主菌GS115及分泌型表达载体pPICZαA在YPM中成功表达了具有抗菌活性的OG2O及PS-OG2，而在BMMY中未检测到表达及活性，提示:诱导培养基及基因GC含量对OG2的表达及活性有显著影响。同时，利用YPM成功分泌表达了具有抗菌活性的PS-OG2。
　　 此外，利用P.pastoris对OG2进行了胞内串联表达。通过BglⅡ及BamHⅠ同尾酶法构建了串联表达载体pAO-OG2（1、2、4、8拷贝），转化GS115获得了重组酵母菌株。通过琼脂糖孔穴扩散法检测细胞裂解液对金黄色葡萄球菌的抑菌活性，结果表明:不同拷贝重组菌株表达产物的抗菌活性随着拷贝数的增加呈现递增趋势。利用酿酒酵母表达系统表达OG2的结果与P.pastoris表达OG2的结果一致，重组菌株裂解液抗菌活性高于对照菌株，但宿主菌本身也存在抗菌物质的表达。
　　 最后，利用P.pastoris在胞内成功表达了带有HIS标签的OG2。使用MMH培养基诱导重组菌株GS115-PICZ-OG2-HIS，通过Ni-NTA亲和层析法纯化细胞裂解液上清中的OG2-HIS，使用SDS-PAGE及Western blot检测到大小约3.2 kDa的OG2-HIS，提示:OG2基因可以在P.pastoris成功转录和翻译。
　　 综上所述，本论文通过对具有高细胞毒性的OG1进行分子改良，获得了抗菌活性更高、细胞毒性显著降低的改良肽OG2和OG2N。与模板肽OG1相比，改良肽OG2和OG2N具有较高的选择性膜破坏作用。在此基础上，利用大肠杆菌及酵母表达系统成功表达了具有抗菌活性的OG2，为研究OG2的结构和功能以及开发新型抗菌制剂奠定了基础。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 蛙类抗菌肽的发现及分类

2 蛙类抗菌肽的功能

2．1 蛙类抗菌肽的抗菌活性

2．2 蛙类抗菌肽的抗病毒功能

3 抗菌肽的分子改良

3．1 α螺旋对抗菌肽抗菌活性的影响

3．2 电荷对抗菌肽抗菌活性的影响

3．3 疏水性对抗菌肽抗菌活性的影响

3．4 两亲性对抗菌肽抗菌活性的影响

4 抗菌肽的抗菌机制

5 抗菌肽基因工程研究进展

5．1 大肠杆菌表达系统

5．2 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统

6 抗菌肽制剂开发现状

7 本研究的目的意义和主要内容

7．1 本研究的目的意义

7．2 本研究的主要内容

第二章 抗菌肽Palustrin-OG1的分子改良及改良肽的筛选

1 OG1的分子改良

1．1 OG1前体肽序列比对及分析

1．2 OG1及其改良肽的序列分析及结构预测

1．3 OG1及其改良肽的化学合成及鉴定

1．4 讨论

2 OG1及其改良肽的抗菌活性及细胞毒性测定

2．1 OG1及其改良肽的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定

2．2 OG1及其改良肽的杀菌曲线测定

2．3 OG1及其改良肽对猪红细胞的溶血率

2．4 OG1及其改良肽OG2-OG2N对猪外周血单个核细胞增殖率的影响

2．5 OG1及其改良肽OG2、OG2N对猪外周血单个核细胞LDH释放率的影响

2．6 讨论

3 OG1及改良肽OG2、OG2N的抗菌机制研究

3．1 透射电镜观察OG1及改良肽OG2、OG2N对细菌形态的影响

3．2 SYTOX摄取试验检测OG1及改良肽OG2、OG2N对细菌细胞膜的影响

3．3 DNA结合试验检测OG1及改良肽OG2、OG2N对DNA的结合能力

3．4 无细胞蛋白合成抑制试验检测OG1及改良肽OG2、OG2N对蛋白合成的抑制作用

3．5 讨论

第三章 改良肽OG2在大肠杆菌中的表达，分离纯化及抗菌活性测定

1 不同分子伴侣对OG2融合蛋白表达的影响

1．1 TrxA、SUMO、intein1及intein2融合表达OG2的技术路线

1．2 不同分子伴侣融合表达OG2的目的基因的克隆

1．3 不同分子伴侣融合表达OG2的重组质粒的构建

1．4 不同分子伴侣对融合蛋白可溶表达的影响

1．5 讨论

2 不同蛋白酶对Trx融合蛋白切割效率的比较

2．1 EK及TEV酶切割Trx-OG2融合蛋白的技术路线

2．2 重组菌株BL21-pET32-TEV-OG2的构建

2．3 Trx-EK-OG2及Trx-TEV-OG2融合蛋白的表达及纯化

2．4 EK及TEV酶切割融合蛋白效率的比较

2．5 重组OG2的活性检测

2．6 讨论

3 利用内含肽系统高效表达及纯化OG2

3．1 重组菌株诱导表达条件的优化

3．2 融合蛋白的小量纯化(1mL Chitin)及目的肽OG2的释放

3．3 融合蛋白的大量纯化(10mL Chitin)及目的肽OG2的释放

3．4 重组OG2的抗菌活性测定

3．5 OG2融合蛋白裂解方式的比较

3．6 讨论

第四章 改良肽OG2在酵母中的表达、分离纯化及抗菌活性测定

1 利用P．pastoris表达系统分泌表达OG2

1．1 P．pastoris分泌表达OG2的技术路线

1．2 OG2、OG2O及路PS-OG2基因的克隆

1．3 P．pastoris分泌表达OG2重组质粒的构建

1．4 P．pastoris分泌表达OG2重组菌株的构建

1．5 P．pastoris分泌表达OG2重组菌株的诱导表达

1．6 P．pastoris重组菌株分泌表达产物的活性测定

1．7 讨论

2 利用P．pastoris表达系统胞内表达OG2

2．1 P．pastoris胞内表达OG2的技术路线

2．2 目的基因克隆及单拷贝重组质粒的构建

2．3 pAO-OG2串联表达载体的构建

2．4 多拷贝重组酵母菌株的构建

2．5 多拷贝重组酵母菌株的诱导表达及活性测定

2．6 讨论

3 利用酿酒酵母表达系统胞内表达OG2

3．1 酿酒酵母胞内表达OG2重组质粒的构建

3．2 酿酒酵母胞内表达OG2重组菌株的构建

3．3 酿酒酵母重组菌株胞内表达产物活性测定

3．4 讨论

4 利用只P．pastoris表达系统胞内表达OG2-HIS

4．1 OG2-HIS的克隆及重组质粒PICZ-OG2-HIS的构建

4．2 P．pastoris胞内表达OG2-HIS重组菌株的构建

4．3 不同培养基及诱导时间对OG2-HIS表达的影响

4．4 OG2-HIS的分离纯化及活性测定

4．5 讨论

第五章 小结、创新点与研究展望

1 小结

2 创新点

3 研究展望

参考文献

附录

作者简历及取得的科研成果