烟草尼古丁合成代谢相关基因研究

摘要

生物体内存在一组小RNA分子，长度通常只有18-24nt。通过在转录水平和/或后转录水平阶段，利用特定碱基配对方式与他们的目标靶基因序列联配，抑制靶基因的表达。植物小RNA作为一种重要的具有调控作用的小分子，在植物生长发育和抵御外部环境过程中扮演着重要的角色。目前已经在许多植物中发现并鉴定了一大批植物特有的miRNA，但在烟草小RNA尚为空白。尼古丁是烟草次生代谢的主要产物，尼古丁可以通过打顶和叶片损伤的方式在烟草体内诱导其合成，尼古丁的代谢途径中许多节点或基因目前尚不清楚。本论文主要开展了非编码小RNA和一个蛋白质编码基因在烟草尼古丁合成与代谢途径相关性研究。主要研究结果如下:
　　 我们通过高通量测序技术对烟草不同组织（根和叶）和不同损伤处理方式（叶片机械损伤和打顶）进行了小RNA测定。通过生物信息学分析，在烟草中检测到了27个植物保守miRNA家族和38个烟草特有miRNA家族（59个miRNA家族成员）;此外我们还在烟草中鉴定出了大批的21或24-nt长度的相位小RNA。通过降解组测序和Northern杂交技术我们对鉴别出的miRNA和相位小RNA的功能进行了进一步的验证和分析，发现了一批同烟草生长发育、尼古丁合成相关的miRNA以及同烟草植株伤害相关的小RNA。通过检测这批小RNA在叶片损伤和打顶伤害处理烟草植株中的表达量变化以及对它们靶基因的功能分析，结果表明烟草植株的抗逆生理反应很有可能是由这些miRNA和相位小RNA共同调控的。
　　 去甲基尼古丁是烟草含量中仅次于尼古丁的一种生物碱，约占总烟草生物碱的3％，其合成的途径主要是通过尼古丁的去甲基化。在前期的工作中我们已经克隆出烟草亚甲基四氢叶酸还原酶基因（MTHFR）并构建了该基因过表达和RNAi干扰转基因植株，本研究利用包括4.5万个基因的烟草基因芯片对MTHFR过表达和敲除的植株进行了表达测定。基于该芯片数据，我们选取了5个于尼古丁代谢途径上的关键调控基因并对其表达量进行进一步的分析。结果表明MTHFR基因的主要功能在于影响尼古丁和去甲基尼古丁之间的转化，因此不对尼古丁生物合成起关键调控作用，对于尼古丁合成途径上游的几个关键基因如PMT、QPT和MPO等的表达并不具备调控功能。
　　 综上所述，烟草体内尼古丁的合成途径是一个很复杂的生理代谢过程，其中包含了大量由不同基因编码的酶类蛋白的催化。在这一过程中miRNA已经被发现可以通过调控其靶基因而参与到这一复杂的生理反应当中，同时随着尼古丁代谢途径研究的不断深入以及烟草全基因组序列工作的完成，将会有更多调控烟草尼古丁代谢途径的基因被发现，从而可以使我们对尼古丁的合成机制有更加深入的理解。

目录

声明

摘要

本文缩写词表

第一章 文献综述

1．1 烟草和烟碱

1．1．1 烟草

1．1．2 烟碱(尼古丁)

1．2 烟草尼古丁的调控和诱导

1．2．1 烟草尼古丁的合成与代谢

1．2．2 转录因子对尼古丁合成的调控

1．2．3 打顶和叶片损伤对烟草尼古丁合成的诱导

1．3 植物内源非编码小RNA在植物生长发育过程中的作用

1．3．1 内源非编码小RNA

1．3．2 植物miRNA及其功能

1．3．4 非编码小RNA在植物抵御生物胁迫和环境胁迫中的功能

1．4 高通量测序技术

第二章 烟草尼古丁合成诱导因子——叶片损伤和打顶相关小RNA分析

2．1 前言

2．2．材料和方法

2．2．1 植物材料和样品制备

2．2．2 烟草RNA的提取和降解组测序

2．2．3 烟草序列分析的数据库信息概要

2．2．4 miRNA和小RNA簇的鉴别

2．2．5 基于降解组测序的小RNA靶基因识别

2．2．6 miRNA表达的Northern杂交验证

2．3 结果与分析

2．3．1 烟草小RNA的高通量深度测序

2．3．2 烟草miRNA和相位siRNA的鉴定

2．3．3 小RNA靶基因的降解组测序鉴定

2．3．4 与打顶和叶片损伤相关小RNA

2．4 讨论与结论

2．4．1 小RNA调控烟草植株伤害应激生理反应

2．4．2 小RNA调控烟草尼古丁合成途径

第三章 烟草亚甲基四氢叶酸还原酶与尼古丁合成相关基因表达的芯片分析

3．1 前言

3．2 材料和方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 结果与分析

3．3．1 烟草MTHFR过表达和RNAi干扰转基因植株基因表达分析

3．3．2 同尼古丁合成相关基因的表达变化分析

3．4 讨论与结论

参考文献

附件

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