耐辐射球菌核酸解旋酶的初步研究

摘要

耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)是至今发现的抗辐射能力最强的生物之一，对电离辐射、UV辐射、过氧化氢等压力具有很强的抗性。耐辐射球菌可以耐受5 kGy的电离辐射而不受影响。高效的DNA修复能力、多种抗氧化机制和快速DNA损伤响应能力，对耐辐射球菌的极端抗性做出了巨大的贡献。DNA与RNA相伴而生，是一对孪生分子。生命的起源可能最早是“核酸世界”，DNA与RNA是后来分化产生的。在生命系统中，DNA、RNA和蛋白质起着决定性的作用，成为生命系统中的三驾马车，核酸解旋酶的重要作用自然不言而喻，而在耐辐射球菌中系统性研究核酸解旋酶的文章却罕见报道。
　　 耐辐射球菌基因组编码了18种核酸解旋酶，本文选取了NCBI注释过的全部3种RNA解旋酶和随机选定的3种DNA解旋酶进行了研究，它们是DR1624、DR0335、DRB0135、DRB0136、DR0065、DR1532。我们首先利用基因重组技术将抗性基因替代目标基因，进而成功地构建了目标基因的敲除突变株。为研究这些激酶在耐辐射球菌电离辐射后恢复中的作用，我们比较了这些突变株与野生株在DNA损伤因子胁迫下的生存率。结果发现，drb0136、dr1532两个基因的突变株抗逆性与野生型菌株相比相差不大，表明这两个基因对抗逆性没有明显的贡献，它们在耐辐射球菌体内不甚重要。而其他四种核酸解旋酶突变菌株对γ辐射、UV辐射和过氧化氢等DNA损伤因子较为敏感。其中dr1624的缺失导致耐辐射球菌对过氧化氢非常敏感。为了更好的理解突变菌株出现的抗逆性表型，我们进一步研究了这6种核酸解旋酶突变菌株的抗氧化活性。结果表明，dr1624、drb0135两个基因突变菌株的抗氧化活性能力最差，与野生型菌株R1相比甚至于出现了4到5倍的巨大差异，而另一个RNA解旋酶突变株的抗氧化活性也比选定的3种DNA解旋酶突变菌株低。表明在耐辐射球菌体内RNA解旋酶体现出了极强的重要性。
　　 dr1624的突变导致耐辐射球菌的生长速度大大降低，而且突变株的生长表现出了明显的温度敏感特性，预示着其可能是一个冷激蛋白。而对于体外活性实验的结果整体来说，RNA解旋酶突变株的敏感性要强于DNA解旋酶的敏感性。这或许是由于耐辐射球菌中具有15种DNA解旋酶以及它本身强大的DNA修复机制所致。
　　 鉴于dr1624缺失突变株的温度敏感性、超低生长速度以及对各种抗逆性的敏感性，特别是对于过氧化氢的敏感性，我们尝试在体外表达了DR1624蛋白，在多次尝试改变条件后，DR1624全长蛋白表达依然失败，我们只表达了其C末端截短体蛋白。同时，我们发现在NCBI上dr1624的基因序列有误，其N末端比实际缺失了部分氨基酸，而且由于移码突变造成了其实际序列提前终止。
　　 本研究表明核酸解旋酶，特别是RNA解旋酶参与了耐辐射球菌的抗性，但是其具体机制尚需进一步的研究。

目录

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论文说明

致谢

摘要

文献综述

1 耐辐射球菌

1．1 细胞结构

1．2 基因组结构

1．3 DNA损伤抗性

1．4 D．radiodurans的抗性机制

2 DEAD-box RNA解旋酶

2．1 简介

2．2 DEAD-box蛋白的结构

2．3 DEAD-box蛋白之间的保守基序和特异性互作

2．4 DEAD-box蛋白家族成员的细胞功能

3 本文研究路线图

第一章 耐辐射球菌核酸解旋酶的生物信息学分析

1．1 引言

1．2 材料和方法

1．2．1 材料

1．2．2 方法

1．3 结果与分析

1．3．1 RNA解旋酶氨基酸序列及motif在线分析

1．3．2 DNA解旋酶氨基酸序列及motif在线分析

1．3．3 六种解旋酶结构域同源性分析序列比对BLAST

1．3．4 耐辐射球菌中所有核酸解旋酶的NCBI注释

1．3．5 耐辐射球菌中所有解旋酶的同源性分析

1．4 讨论

第二章 耐辐射球菌解旋酶突变株的构建与鉴定

2．1 引言

2．2 实验材料与仪器

2．2．1 菌株和试剂

2．2．2 仪器与设备

2．3 实验方法

2．3．1 菌株培养

2．3．2 基因缺失突变株的构建方法

2．3．3 体外“三段连接”

2．3．4 连接产物转化耐辐射球菌

2．3．5 突变株的鉴定

2．4 电离辐射处理

2．5 结果和分析

2．5．1 ΔDR0335缺失突变株的构建

2．5．2 ΔDRB0135缺失突变株的构建

2．5．3 ΔDR1624缺失突变株的构建

2．5．4 ΔDR0065缺失突变株的构建

2．5．5 ΔDR1532缺失突变株的构建

2．5．6 ΔDR0135-0136双突变体的构建

2．5．7 ΔDR1624补偿株的构建

2．5．8 突变菌株电离辐射敏感特性初窥

2．6 讨论

第三章 突变株特性及功能补偿活性分析

3．1 引言

3．2 材料、试剂与主要设备

3．2．1 材料和试剂

3．2．2 主要仪器

3．3 实验方法

3．3．1 生长曲线测定

3．3．2 菌株抗逆性处理

3．4 结果与分析

3．4．1 ΔDR1624菌株的生长出现了严重的延滞

3．4．2 不同温度下固体培养基DR1624突变株的生长状况

3．4．3 突变株对γ电离辐射的抗性

3．4．4 突变株对紫外辐射的抗性

3．4．5 突变株对H2O2的抗性

3．5 讨论

第四章 突变菌株抗氧化活性分析

4．1 引言

4．2 材料、试剂与主要仪器

4．2．1 材料和试剂

4．2．2 主要仪器

4．3 NBT法测量SOD活性

4．3．1 NBT法反应原理

4．3．2 样品准备

4．3．3 溶液的配制

4．3．4 样品测定

4．3．5 样品中总SOD活力的计算

4．4 过氧化氢酶活性检测

4．4．1 反应原理

4．4．2 样品准备

4．4．3 溶液配制

4．4．4 标准曲线的测定

4．4．5 样品测定

4．4．6 样品中过氧化氢酶酶活力的计算

4．5 ABTS快速法测量细胞总抗氧化活性

4．5．1 反应原理

4．5．2 样品准备

4．5．3 溶液配制

4．5．4 标准曲线的测定

4．5．5 总抗氧化能力的测定

4．6 结果与分析

4．6．1 菌株体外SOD活性

4．6．2 菌株体外过氧化氢酶活性

4．6．3 菌株体外总抗氧化活性

4．7 讨论

第五章 耐辐射球菌DR1624蛋白的体外表达

5．1 材料、试剂与设备

5．1．1 菌株与质粒

5．1．2 主要试制

5．1．3 主要仪器与设备

5．2 实验方法

5．2．1 大肠杆菌感受态制备

5．2．2 dr1624基因的克隆

5．2．3 DR1624蛋白表达质粒的构建

5．2．4 DR1624蛋白的表达

5．2．5 镍柱纯化

5．3 结果与分析

5．3．1 dr1624基因ORF的实际长度为1791bp

5．3．2 DR1624蛋白体外表达失败

第六章 总结与展望

参考文献

已发表论文