耐辐射式球菌双链DNA修复系统RecF途径的关键解旋酶DrRedcQ的结构与功能研究

摘要

RecQ作为DNA解旋酶无论是从单细胞的细菌还是到人类对于基因组完整性的保持和维护都起到了十分重要的作用。与其他解旋酶家族类似，RecQ蛋白需要在ATP存在的情况下解旋双链DNA。但是，不同于其他家族的解旋酶，RecQ蛋白有着不同寻常的广泛的应用活性，包括DNA复制，DNA重组和修复等1。人类如果缺失RecQ基因功能会引起癌症易感性和早衰。因此，近些年来RecQ家族蛋白引起了广泛的关注和研究，不仅仅是因为它们对基因组的不稳定起到抑制作用，更是因为可以避免人类的某些疾病。
　　 第一个RecQ家族的蛋白是由Nakayama and Umezu通过筛选大肠杆菌发现的抗胸腺嘧啶缺陷致死的菌株中发现的2,3。这个蛋白作用在RecF基因重组修复系统中。RecF通路参与同源重组和由紫外线诱导所致的DNA损伤修复中4。RecQ和RecF通路中的其他蛋白帮助修复停止在DNA损伤位点的复制叉5。RecQ蛋白在至今所有得到全基因组序列的生物中都得到了鉴定。三种保守的结构域存在于RecQ家族蛋白中:Helicase（解旋酶），RecQ-C-terminal(RecQ-Ct)和Helicase-and-RNaseD-like-C-terminal(HRDC)6。在这三种保守结构域中，HRDC结构域形成一个独立的螺旋束和参与DNA结合反应，尤其是在某种程度上决定了DNA底物的特异性7,8。
　　 双链DNA断裂被认为是最严重的基因组损伤。耐辐射式球菌(D.radiodurans)作为可以耐受极高强度的干旱和离子损伤而造成的大范围的DNA双链断裂而得到广泛认可。因此，其强大的辐射耐受性使耐辐射球菌成为一个研究DNA修复系统的模式生物7。相比于其他所有的RecQ家族的得到鉴定的蛋白质，耐辐射式球菌D.radiodurans中的RecQ家族的蛋白DrRecQ在其蛋白质序列的C端有三个HRDC结构域。DrRecQ蛋白有着特殊结构域分布的蛋白结构引起了科研学者的广泛兴趣:这种细菌极高的辐射耐受及其高效的DNA损伤修复能力可能就是源于其蛋白质结构的特殊性。DrRecQ蛋白各个结构域的截短变异体的体外生化实验证明在耐辐射式球菌中解旋酶和HRDC结构域对于DrRecQ蛋白质功能的发挥都是至关重要的，并且这三个HRDC结构域在整体功能的发挥上具有协同作用9。
　　 本文我们旨在阐明作为被证明是耐辐射式球菌中主要的双链DNA重组修复系统的RecF途径的第一个关键酶DrRecQ的真实功能和调节机制的研究。在这篇文章中，我们重点研究了DrRecQ全长蛋白和两个截短的蛋白——DrRecQ1-824(Helicase+RecQ-Ct+3 HRDC),DrRecQ1-610(Helicase+RecQ-Ct+HRDC1)andDrRecQ1-520(Helicase+RecQ-Ct)的结构和生物化学功能的研究。作为一个解旋酶，在ATP不存在的情况下DrRecQ可以与不同种类的DNA底物结合，但是其结合能力的强弱以DNA底物的不同而有差异。当ATP存在时，DrRecQ可以高效解旋双链DNA和Holliday junction。这里我们应用凝胶电泳迁移分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)实验来检验DrRecQ和不同DNA底物的结合强弱及其解旋酶活性的检测。另外，我们得到了以上三种蛋白的蛋白质晶体。但是，DrRecQ全长的晶体结构可能很难得到:因为HRDC1和HRDC2之间的长Loop区可能会影响晶体的质量，也很难对其整体的结构进行细致性的分析。小脚散射（Small Angel X-ray Scattering，SAXS）是一种非常强大的生物大分子结构检测方法，尤其对接近于其生理状态的溶液状态的生物大分子的结构分析更加有效。我们应用小脚散射的目的首先是希望得到溶液状态下全长的DrRecQ蛋白质和DrRecQ1-610的结构解析，再次进行DrRecQ蛋白质与不同种类的DNA底物的相互作用的研究，最后基于小脚散射的数据来对完整的分子结构模型进行构建。目前我们通过对小脚散射的数据进行解析对上述两种蛋白质中解旋酶和HRDC在溶液中的模型进行了成功组建。分离得到的部分DrRecQ蛋白质的高分辨率结构被应用的小脚散射的数据当中用来对比和建模。小脚散射的数据通过与DrRecQ1-610的对比得到了完整的DrRecQ1-824全长蛋白质的结构。在溶液中两种蛋白的解旋酶部分都是呈现圆形的结构，但是与晶体结构中不同的是在其中间有空洞出现。从我们得到的所有的实验数据推断DrRecQ蛋白不仅仅可以在RecF途径的第一步那样解旋双链的DNA底物，而且HRDC结构域可以帮助DrRecQ蛋白与Holliday junction有很好的结合能力。因此，DrRecQ可能参与到同源重组的最后一步——双链Holliday junction的分解或解析过程中。

目录

声明

摘要

第一章 前沿

一、研究背景

1．耐辐射式球菌Deinococcus radiodurans简介

2．DNA的损伤修复途径简介

3． RecQ蛋白的研究概况

二、研究内容、目的与意义

第二章 研究材料与方法

1．菌株和质粒

2．实验试剂和工具酶

3．主要仪器

4．实验流程和方法

4．1 基因的克隆

4．2 蛋白质表达与纯化

4．3 晶体生长和数据收集

4．4 小角散射的样品准备和数据收集

4．5 生化功能分析

第三章：实验结果与分析

1、DrRecQ的克隆和蛋白质的表达纯化

1．1 DrRecQ蛋白质的初步表达纯化

1．2 DrRecQ去除杂质DNA的纯化

1．3 DrRecQ蛋白质纯化小结

2、蛋白质的结晶优化及水溶液中蛋白小角实验分析

2．1 蛋白质结晶和优化

2．2 DrRecQ1-824和DrRecQ1-610的小角数据分析

2．3 DrRecQ1-520蛋白质晶体结构

3、DrRecQ的生化实验结果与分析

3．1 ATP水解实验

3．2 EMSA实验结果与分析

3．2 DrRecQ1-824蛋白质Helicase地括性检测

全文总结与展望

附录

参考文献

致谢

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