CO2加富环境下番茄-病原生物互作关系变化及其生理与分子机制

摘要

自从工业化以来，大气中的CO2浓度已由100多年前的280μL/L左右快速升高到目前的380μL/L左右，并预计到本世纪末将达到730-1020μL/L。掌握CO2加富下植物各个方面的变化可以使我们了解未来某个时期植物生长发育的变化，并根据其变化制定农业发展的战略以发挥优势规避劣势。在我国现代设施农业生产中，CO2加富日渐成为人们控制设施环境，调控作物生长发育的重要手段。多数研究者针对CO2浓度变化环境下植物的光合碳代谢、生态系统结构功能等开展了大量的研究，但关于在CO2浓度变化下病原生物对植物影响的研究十分有限。而植物病害是导致蔬菜等农作物产量下降和品质变劣的重要原因之一。因此，研究CO2浓度变化下作物与病原的互作关系，不仅有助于了解以大气CO2浓度上升为主要特征的未来气候变化下全球初级生产力变化特征，更加能够揭示CO2环境—作物—病原互作变化及其机制，对于设施农业生产实践中如何利用CO2加富的优势而规避其劣势具有十分重要的指导意义。
　　 本论文以番茄为对象，研究了人工控制环境CO2升高环境下三种典型病原生物烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus(TMV)、丁香假单胞细菌Pseudomonas syringae pv.tomatoDC3000(Pst DC3000)及灰霉病原菌Botrytis cinerea(B.cinerea)对植物的影响及其互作关系。主要结果如下:
　　 1.CO2加富环境下番茄——TMV病毒互作关系变化
　　 利用人工控制环境提高CO2浓度，研究CO2加富下番茄接种TMV后基础抗性的变化。结果显示:CO2加富环境下TMV接种后番茄系统叶中TMV-CP的累积比正常CO2环境下相比明显减少。CO2加富及TMV接种条件下番茄体内水杨酸合成基因ICS1和PAL表达量提高;自由态和结合态水杨酸的含量增加;SA抗性信号路径的关键基因NPR1和PR1的表达量均在CO2加富及TMV接种条件下显著上调。而JA路径元件在CO2加富及TMV接种下均无明显变化。因此CO2加富下番茄对TMV基础抗性的提高可能与CO2加富环境下SA抗性路径的增强有关。
　　 2.CO2加富下番茄——PstDC3000细菌性病原菌互作关系变化
　　 CO2加富环境下，番茄对细菌性病害PstDC3000的抗性增加。CO2加富及接种PstDC3000条件下番茄体内水杨酸合成基因ICS1和PAL表达上调，自由态和结合态水杨酸的含量增加。与TMV接种实验结果类似，SA抗性信号路径的关键基因NPR1和PR1的表达量均在CO2加富和接种PstDC3000后上调。对于未接种病原菌的番茄植株，JA信号途径中的下游原件PIⅠ和PIⅡ的表达量在CO2加富和对照环境下差异不大。但接种PstDC3000后PIⅠ和PIⅡ的表达量与mock植株相比显著上调;CO2加富环境下接种PstDC3000后PIⅠ和PIⅡ的表达量少于对照环境下的番茄。CO2加富下番茄对细菌性病害PstDC3000的抗性增加与SA信号途径在CO2加富环境下增强有关;而作为JA信号路径的元件PIⅠ和PIⅡ在对PstDC3000的抵抗中起到的作用较SA信号途径比较小。
　　 3.CO2加富下番茄—Botrytis cinerea真菌性病原菌的互作关系变化
　　 CO2加富环境下，番茄对真菌性病害B.cinerea的抗性减弱。CO2加富及接种灰霉病原菌后番茄体内水杨酸信号元件中NPR1和PR1均显著上调，JA信号途径中的原件PIⅠ和PIⅡ的表达量在接种灰霉病原菌后显著上调。但CO2加富环境下接种灰霉病原菌后番茄体内PIⅠ和PIⅡ的表达量均显著低于对照环境。由此可见PIⅠ和PIⅡ的表达在CO2加富下受到抑制可能是灰霉病发病严重的原因。
　　 4.番茄NPR1及PI沉默后CO2加富对TMV、PstDC3000、及B.cinerea抗性的影响
　　 采用VIGS方法沉默NPR1基因，在降低NPR1及PR1基因表达的同时，提高了PIⅠ、PIⅡ基因的表达，从而削弱了CO2加富下TMV和PstDC3000的抗性效应及B.cinerea的敏感性;沉默PI基因对NPR1及PR1基因的表达无明显影响，因此加剧了CO2加富下番茄对B.cinerea的敏感性。研究发现番茄PIⅠ和PIⅡ沉默后对TMV的抗性不变;而对PstDC3000抗性减弱。由接种病毒后番茄体内PIs的表达量增加也不明显来看，JA信号途径的下游因子PIⅠ和PIⅡ可能不参与到对TMV的抗性中，而参与到对活体营养型病原菌PstDC3000的抗性中。因此我们认为CO2加富下番茄与病原菌的互作关系变化与内源信息物质SA、JA间的交叉对话有关。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 CO2加富及其与农业生产

1．2 CO2加富与病原互作

1．2．1 植物抗病机制

1．2．2 植物激素信号途径与抗性

1．2．3 CO2加富下植物与病原菌的互作

1．3 本文研究的目的意义

2 CO2加富环境下番茄——TMV病毒互作关系变化

2．1 材料与方法

2．1．1 材料及培养

2．1．2 实验设计

2．2 试验方法

2．2．1 生物量的测定

2．2．2 叶绿素荧光成像分析

2．2．3 总RNA的提取、纯化和cDNA的合成

2．2．4 Real-time PCR分析基因的相对表达量

2．2．5 自由态及结合态水杨酸含量测定

2．2．6 苯丙氨酸解氨酶活性测定

2．2．7 次生代谢物质含量测定

2．3 结果与分析

2．3．1 TMV接种番茄在CO2加富及对照环境下表观及生长量的差异

2．3．2 CO2加富下TMV接种后植物生长量的变化

2．3．3 CO2加富下接种TMV的番茄体内TMV-CP基因表达

2．3．4 番茄抗病相关的基因表达

2．3．5 水杨酸合成相关基因及酶的变化

2．3．6 水杨酸(SA)含量的变化及趋势

2．3．7 CO2加富下番茄次生代谢的变化

2．4 讨论

3 CO2加富下番茄——PstDC3000细菌性病原菌互作关系变化

3．1 实验方法

3．1．1 PstDC3000菌种的获得及培养

3．1．2 番茄PstDC3000接种

3．1．3 台盼蓝染色方法

3．1．4 DAB及NBT染色方法

3．1．5 木质素含量的测定

3．2 结果与分析

3．2．1 注射接种法结果

3．2．2 抽真空接种法结果

3．2．3 番茄抗病相关基因的表达量及酶活的变化

3．2．4 PstDC3000接种后番茄体内自由态和结合态水杨酸含量的变化

3．2．5 PstDC3000接种后番茄体内木质素含量的变化

3．3 讨论

4 CO2加富下番茄——Botrytis.cinerea真菌性病原菌的互作关系变化

4．1 实验方法

4．1．1 Botrytis cinerea的培养

4．1．2 Botrytis cinerea孢子的获取及接种处理

4．1．3 Botrytis cinerea生长量测定

4．2 结果分析

4．2．1 CO2加富下灰霉原菌的生长情况

4．2．2 CO2加富下番茄接种灰霉病原菌后的发病结果

4．2．2 水杨酸下游信号基因的表达

4．2．3 茉莉酸响应基因的表达

4．3 讨论

5 番茄NPR1及PI沉默后CO2加富对TMV、PstDC3000、及B.cinerea抗性的影响

5．1 材料与试剂

5．1．1 植物材料

5．1．2 载体构建

5．2 实验方法

5．3 结果与分析

5．3．1 番茄NPR1和PI基因沉默后表型及相关基因表达

5．3．2 NPR1和PI基因沉默后的番茄对烟草花叶病毒抗性的变化

5．3．3 NPR1和PI基因沉默后的番茄对PstDC3000抗性的变化

5．3．4 NPR1和丹基因沉默后的番茄对灰霉病原菌抗性的变化

5．4 讨论

6 结论

参考文献

个人简历

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