体外药动/药效联合模型中盐酸沃尼妙林对金黄色葡萄球菌的作用研究

摘要

金黄色葡萄球菌是重要的机会性致病菌，常引起化脓性疾病和人与动物的毒素休克综合症等，危害很大。现有资料表明，该菌是容易对抗菌药物产生耐药性的细菌之一，且耐药问题日渐严重。耐药性问题不断加剧，而新型抗茵药物问世却日益减少，如何合理优化应用现有抗菌药物对抗微生物感染已成为当务之急。药动/药效联合模型(PK/PD)将药动学和药效学结合起来，测定血药浓度-时间-效应数据，可以拟合出药物浓度及其效应的经时曲线，能够优化给药方案，使抗菌药物在提高药效的同时，较好地控制耐药性的发生、发展。盐酸沃尼妙林是近年来获准上市的二类新兽药，抗菌谱广、抗菌活性强，可有效控制革兰氏阳性菌、支原体和螺旋体等感染，具有广阔应用前景。目前，盐酸沃尼妙林在国内外的研究主要集中在药效和残留方面，其药动/药效联合模型的研究未见报道。本文通过体外药动/药效模型研究了盐酸沃尼妙林对金黄色葡萄球菌的作用，主要有以下内容:
　　1.微量稀释法测定了LB培养基中盐酸沃尼妙林对金黄色葡萄球菌ATCC25923的最低抑菌浓度为0.125μg/ml，说明金黄色葡萄球菌对盐酸沃尼妙林比较敏感。
　　2.使用液质联用法(LC-MS)定量检测LB培养基中盐酸沃尼妙林。取500μl样品加入500μ l乙腈后12000r/min离心30 min，吸取样品500μ l通过0.22μm滤膜过滤除菌后进入LC-MS系统分析。液相工作条件为:流动相A:甲酸(0.1％)水溶液;流动相B:乙腈;梯度洗脱。流速为0.2 ml/min，柱温35℃C，进样量为10μl。质谱工作条件:电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应检测模式(MRM)，电喷雾电压(IS)5500V，雾化气压力(GS1)50 psi，辅助气流速(GS2)35 L/min，气帘气压力(CUR)20 psi，离子源温度(TEM)600℃，碰撞室压力(CAD)4 psi，用于定量分析的离子反应分别为m/z565.3-＞263.1: CE（碰撞能量）22，CXP（碰撞室出口电压）23; m/z565.3-＞164.0: CE（碰撞能量）45，CXP（碰撞室出口电压）21。经测定得到标准曲线方程:y=3E+08x-282147(R2=0.9999)，在LB培养基中盐酸沃尼妙林的浓度在0.001～0.25μ g/ml范围内线性相关，回收率为87.33～94.83％，批内变异系数为1.534、1.690、2.039％，批间变异系数为2.135％。
　　3.建立了盐酸沃尼妙林对金黄色葡萄球菌的体外PK/PD模型。取灭菌干燥的400ml玻璃密闭容器，加入200ml的LB培养基，再加入一定量的盐酸沃尼妙林(1024μg/ml)和对数期的金黄色葡萄球菌菌液。药物浓度的减少通过两个恒流蠕动泵完成，其中一个蠕动泵向密闭容器泵入灭菌LB，另一个蠕动泵从容器底部泵出LB，为防止泵出细菌，底部为可换膜滤器（滤膜直径5cm，孔径0.45μm），调节蠕动泵使模型t1/2β（消除半衰期）为2h、3h。经3p97软件分析表明，模型的药动学符合静脉注射的一室模型，r2=0.997±0.002，平均t1/2β（消除半衰期）分别为2.04±0.10、2.96±0.12h。
　　4.通过模型模拟了盐酸沃尼妙林在猪体内的药物动力学过程，通过定时检测模型内的细菌数量来考察盐酸沃尼妙林的药效，研究药动/药效关系。结果显示，在半衰期为2h时，2MIC(T＞MIC为1.89±0.06h)、4MIC(T＞MIC为3.82±0.15h)的盐酸沃尼妙林能分别抑制金葡菌2h、4h;8 MIC(T＞MIC为6.33±0.24h)、16MIC(T＞MIC为8.42±0.25h)的盐酸沃尼妙林能对细菌起到持续抑制作用。在半衰期为3h时，2 MIC的盐酸沃尼妙林能在3h内抑制金葡菌;4 MIC(T＞MIC为6.35±0.19h)、8MIC(T＞MIC为8.63±0.27h)、16MIC(T＞MIC为11.55±0.46h)能对细菌起到持续抑制作用。由此推测，盐酸沃尼妙林对金黄色葡萄球菌的抗菌作用具有时间依赖的特点，完全杀灭的必要条件是T＞MIC时间在6h以上。
　　本研究表明，要使盐酸沃尼妙林对金黄色葡萄球菌发挥理想的抗菌效果，在制订给药方案时，使药物浓度大于有效浓度的时间超过6h是必要的。

目录

声明

缩略语表

摘要

1．前言

1．1 立题背景与意义

1．2 盐酸沃尼妙林研究进展

1．2．1 截短侧耳素类药物的发展史

1．2．2 盐酸沃尼妙林的结构和理化性质

1．2．3 盐酸沃尼妙林作用机理

1．2．4 盐酸沃尼妙林药动学研究

1．2．5 盐酸沃尼妙林药效学研究

1．2．6 盐酸沃尼妙林的毒理学研究

1．3 体外药动/药效同步模型研究进展

1．3．1 概述

1．3．2 药动学、药效学以及药动/药效同步模型的一些基本参数

1．3．3 研究方法

1．3．4 几类常见抗菌药物药动/药效模型的研究成果

2．材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 药品和试剂

2．1．3 仪器

2．2 实验方法

2．2．1 MIC的测定

2．2．2 细菌计数

2．2．3 体外药动/药效模型的建立

2．2．4 消除半衰期(t1/2β)及蠕动泵流速的确定

2．2．5 模型内的抑菌曲线的绘制

2．2．6 盐酸沃尼妙林在LB培养基中定量分析方法

2．2．7 数据处理

3．结果

3．1 盐酸沃尼妙林对金黄色葡萄球菌的MIC

3．2 盐酸沃尼妙林LC-MS分析

3．2．1 盐酸沃尼妙林色谱质谱图

3．2．2 标准曲线和相关系数

3．2．3 回收率和精密度

3．3 体外PK/PD模型

3．3．1 药动学

3．3．3 药效学

3．3．4 模型中的一些参数

4．分析和讨论

4．1 盐酸沃尼妙林对金黄色葡萄球菌的MIC

4．2 定量方法的确定

4．2．1 液质连用(LC-MS)测定盐酸沃尼妙林的浓度

4．2．2 前处理方法

4．2．3 定量分析的离子反应

4．3 体外药动/药效模型

4．3．1 模型的建立

4．3．2 模型参数分析

结论与展望

5．1 结论

展望

参考文献

攻读硕士期间发表及录用的学术论文

致谢