端粒酶逆转录酶过表达增强多发性骨髓瘤细胞的增殖与抗凋亡能力及其机制的研究

摘要

研究背景:
　　多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是以骨髓浆细胞恶性增殖为特征的恶性肿瘤，发病率约占血液系统恶性肿瘤的10％。随着新药蛋白酶体抑制剂以及免疫调节剂进入临床，MM的生存期明显延长。尽管大多数初治的MM患者对治疗敏感，但是几乎所有患者均会复发并最终对治疗无效。所以到目前为止，MM仍被认为是不可治愈的疾病。
　　MM的遗传学背景非常复杂，有多种途径参与了MM的耐药机制，目前已知的主要有P-gp、MRP、LRP等药物转运蛋白以及以IL-6为代表的生长因子和BCL-2、NF-κB等内源性抗凋亡因子。早前的临床研究曾用维拉帕米、奎宁、环孢霉素A等药物逆转P-gp等外排泵介导的MM耐药，但效果有限。新药蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂以及砷剂等均可直接或间接抑制IL-6、BCL-2以及NF-κB等抗凋亡因子，虽然初期治疗效果明显，但仍不能治愈该疾病。所以目前仍有必要寻找新的MM治疗的靶点。
　　端粒(telomere)是染色体末端的特殊帽状结构，随着每次染色体的分裂而缩短，当其长度达到临界状态是即诱发细胞衰老与死亡。端粒酶(telomerase)的主要作用是以自身RNA亚基(TERC)为模板，利用其逆转录酶亚基(TERT)逆转录合成端粒重复序列并添加于染色体末端，从而维持端粒长度的稳定。端粒酶在绝大多数的恶性肿瘤细胞中被激活，使细胞获得永生化能力。此外，端粒酶的激活还能通过多种途径调节肿瘤细胞的增殖与凋亡，增强细胞对化疗药物、氧化损伤以及电离辐射的抵抗性。
　　MM的耐药与其增殖和凋亡能力密切相关。目前，端粒酶的激活通过哪些下游途径调节MM细胞的增殖与抗凋亡，尚不明确;而且端粒酶本身及其下游的调节途径，可能存在有效的治疗MM的靶点。所以，我们将TERT基因通过复制缺陷型腺病毒载体导入MM细胞，通过检测细胞的增殖、凋亡以及细胞内信号转导途径的变化，来明确端粒酶激活对MM细胞耐药的影响。研究分两部分进行。第一部分为TERT-腺病毒载体的构建与包装;第二部分为TERT过表达后MM细胞增殖、凋亡的变化以及机制的研究。
　　第一部分:负载TERT基因的非增殖型腺病毒载体的构建与包装
　　背景:腺病毒表达载体具有一系列独特的优点:1.与人类基因同源，因而目的蛋白的表达水平高，功能完全;2.腺病毒基因不会与宿主染色体基因整合，因而不会对宿主基因产生非特异性干扰，也不会导致插入行突变，从而使目的基因准确表达;3.感染效率高，对增殖细胞与非增殖细胞均有感染力;4.腺病毒基因组进入细胞核的效率高达40％;5.安全性好，对人的致病力与致突变力低。基于上述优点，我们选择非复制型腺病毒表达载体来构建TERT基因的转染平台。
　　方法:通过酶切的方法，从质粒PIRES2-EGFP-TERT与PDC318载体中获得目的基因TERT与PDC318，连接后转入DH5α大肠杆菌感受态细胞重组为PDC318-TERT质粒，然后导入HEK-293A细胞中包装为负载TERT基因的复制缺陷型腺病毒颗粒，经PCR方法鉴定正确后再用HEK-293A细胞大量扩增、HPLC纯化，用TCID50（50％组织培养感染剂量）法测定病毒滴度备用。
　　结果:获得VDC318-TERT非增殖型腺病毒表达载体，测定病毒颗粒滴度为3.5×109 PTU/ml。
　　第二部分:TERT基因过表达对骨髓瘤细胞增殖与抗凋亡能力的影响以及机制的研究
　　目的:研究骨髓瘤细胞过表达TERT基因后增殖与抗凋亡能力的变化，主要的细胞内增殖通路与凋亡通路的信号变化，IL-6信号通路的变化，耐药蛋白表达(的)变化，潜在的抗骨髓瘤治疗的靶点。
　　方法:以5-10 MOI的病毒量转染骨髓瘤细胞株RPMI-8226与U-266，用荧光显微镜、RT-PCR、Western Blot以及TRAP-ELISA方法验证病毒的感染效率以及转染后24、48、72小时的TERT表达。用MTT、流式细胞AV-PI法检测转染前后胞在不同浓度的表阿霉素压力下细胞增殖与凋亡率的变化。用RT-PCR方法检测转染前后骨髓瘤细胞的耐药基因表达量。用Realtime PCR、ELISA方法检测转染前后骨髓瘤细胞的IL-6及其受体的表达量变化。用Western Blot方法检测转染前后()相关蛋白的表达，ERK1/2 MAPK通路的表达以及PI3K/AKT/mTOR（）表达。
　　结果:腺病毒(载体)对多发性骨髓瘤细胞株RPMI-8226与U-266细胞株的感染率约为90％。（转）染后RPMI-8226与U-266细胞株的TERT mRNA表达量上调约()RT蛋白表达上调约2-7倍，端粒酶活性上调2-3倍。半定量RT-PCR()发现，8226-TERT细胞的多药耐药基因(MDR1/GP170)mRNA表达上调约(1)0-15倍，而U266-TERT细胞的MDR1/GP170 mRNA表达无明显变化;多药耐药相关蛋白(MRP)mRNA、肺耐药相关蛋白（LRP/MVP）mRNA的表达量无明显变化。TERT过表达后IL-6及其受体IL-6R、gp130的mRNA表达量无明显变化;ELISA方法检测8226-TERT细胞培养上清液的可溶性IL-6R浓度显著低于RPMI-8226细胞以及8226-GFP细胞，而8226-TERT细胞培养上清液的可溶性gp130的浓度显著高于RPMI-8226细胞以及8226-GFP细胞。Western Blot检测发现，TERT过表达后8226细胞的p-AKT与p-mTOR的表达显著上调，p-ERK、c-MYC的表达显著下调。流式AV-PI法检测发现，用100nM与200nM的表阿霉素处理24小时，8226-TERT细胞的凋亡率分别下降21.73％与21.58％，P值分别为0.113与0.041。用MTT法检测显示，8226-TERT细胞对表阿霉素的48小时IC50上调59.31％，P=0.043; U266-TERT细胞对表阿霉素的48小时IC50上调147.12％，P=0.024。
　　结论:VDC318-TERT腺病毒表达载体能在骨髓瘤RPMI-8226细胞与U-266细胞中高效表达TERT基因。TERT基因过表达使骨髓瘤细胞获得更高的增殖与抗凋亡能力，对表阿霉素的抗药性显著增加，可能与过度激活PI3K/AKT/mTOR信号通路的磷酸化直接相关。TERT过表达抑制了ERK1/2 MAPK信号，同时抑制了转录因子c-Myc的表达。TERT基因的过表达在转录后水平抑制了IL-6及其受体信号通路的功能。TERT基因的过表达对MDR1、MRP、LRP等常见的骨髓瘤耐药基因的表达无明显影响。