慢性HBV感染进程中Tim-3分子对CD8+T细胞及单核细胞功能的不同调节作用

摘要

研究背景与目的：
　　慢性乙型肝炎病毒感染(chronic hepatitis B virus infection)是威胁全球的重大公共健康问题。慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)及慢性乙型肝炎肝硬化(hepatitis B virus related-cirrohosis，HBV-related cirrhosis)是慢性乙型肝炎病毒感染进展的先后两个病理阶段。CHB患者主要表现为病毒特异性的适应性免疫功能失活，而严重的慢性乙型肝炎肝硬化患者则进一步会出现固有免疫功能的紊乱。目前，在HBV感染自然史的不同阶段，调控适应性及固有免疫功能变化的分子机制尚不明确。T细胞免疫球蛋白及粘蛋白分子-3(T cell Immunoglobulindomain and Mucindomain protein-3，Tim-3)是近年来发现的免疫调控分子，既表达于适应性免疫细胞如CD4+及CD8+T细胞，也表达于固有免疫细胞如单核细胞，树突状细胞，肥大细胞等，因此Tim-3具有广泛的免疫调控功能。本课题旨在研究在慢性乙型病毒性肝炎及慢性乙型肝炎肝硬化阶段CD8+T细胞及单核细胞功能的分别改变，及Tim-3在慢性乙型病毒性肝炎及慢性乙型肝炎肝硬化阶段分别对CD8+T细胞及单核细胞功能的调控作用，从而进一步理解慢性HBV感染进展的免疫学特点并为寻求新的治疗方法提供理论依据。
　　研究方法：
　　1.Tim-3调控CD8+T细胞功能收取125例CHB患者及招募的54例健康志愿者外周血并使用流式细胞术检测总CD8+T细胞表面Tim-3表达。同时分选CD8+T细胞，使用五聚体技术检测HBV特异性CD8+T细胞表面的Tim-3表达。流式细胞术比较Tim-3+/-CD8+T细胞的表型及细胞因子分泌功能。分离患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell，PBMC)，分别予HBV抗原肽段、12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(phorbol12-myristate13-acetate, PMA)/离子霉素(ionomycin)及抗人CD3抗体刺激及Tim-3通路阻断后，ELISA法检测细胞培养上清液细胞因子分泌，流式细胞术检测胞内干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)分泌，羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyflu-oresceindiacetate succinimidyl ester, CFSE)法检测CD8+T细胞增殖。
　　2.Tim-3调控单核细胞功能
　　收取79例慢性乙型肝炎肝硬化患者及31例招募的例健康志愿者外周血并使用流式细胞术检测总CD14+单核细胞表面Tim-3表达。同时使用显色基质法检测患者及健康志愿者血浆内毒素。同时分选CD14+单核细胞，体外使用内毒素刺激单核细胞并检测Tim-3的动态变化。同时比较Tim-3+/-CD14+单核细胞的表型。分离患者及健康志愿者PBMC或分选CD14+单核细胞，予内毒素刺激及/或Tim-3通路阻断后，流式细胞术比较患者与健康人的单核细胞的吞噬功能、细胞因子分泌及HLA-DR表达，ELISA法检测上清诱导型一氧化氮合酶分泌。
　　研究结果：
　　1.Tim-3调控CD8 T细胞功能
　　(1)慢乙肝患者CD8+T细胞表面Tim-3表达较健康对照升高，且Tim-3表达水平与ALT呈正相关。抗病毒治疗后CD8+T细胞的Tim-3表达水平明显下降。
　　(2)慢乙肝患者HBV特异性CD8+T细胞表面Tim-3表达水平高于CMV特异性CD8+T细胞Tim-3表达。
　　(3) Tim-3+CD8+T细胞中终分化效应记忆性细胞(terminally differentiation effectormemory, TDEM)的比例高于Tim-3-CD8+T细胞，而初始性细胞的比例低于Tim-3-CD8+T细胞。
　　(4) Tim-3+CD8+T细胞的CD127表达低于Tim-3-CD8+T细胞，而CD57表达高于Tim-3 CD8+T细胞。Tim-3+CD8+T细胞在抗原刺激后分泌IFN-γ的水平低于Tim-3-CD8+T细胞。
　　(5)阻断Tim-3通路后能够显著恢复病毒特异性CD8+T细胞的细胞因子分泌及增殖能力，但不能提高对非特异抗原刺激的应答能力。
　　3.Tim-3调控单核细胞功能
　　(1)严重的慢性乙型肝炎肝硬化失代偿患者CD14+单核细胞表面Tim-3表达较正常人明显下降。
　　(2) CD14+单核细胞Tim-3表达下降与患者内毒素血症有关。体外LPS刺激能够诱导单核细胞Tim-3表达下降。
　　(3) Tim-3+CD14+单核细胞表达CD1a及CD83较Tim-3-细胞高，但CD80及CD86表达较低。
　　(4)严重的慢性乙型肝炎肝硬化失代偿患者单核细胞吞噬功能较正常人为低，HLA-DR表达水平降低，而iNOS分泌能力则升高，分泌促炎细胞因子TNF-α，IL-1β和抑炎细胞因子IL-10水平均升高。
　　(5)阻断Tim-3通路可下调单核细胞吞噬功能，降低iNOS分泌水平，抑制TNF-α分泌水平而提高IL-10水平，但对HLA-DR表达没有影响。
　　研究结论：
　　(1)Tim-3通路负性调控慢乙肝患者HBV特异性的CD8+T细胞应答。
　　(2)慢性乙型肝炎肝硬化患者单核细胞存在免疫功能紊乱，且与病情严重程度相关。Tim-3表达下降导致单核细胞从促炎表型向抑炎表型转变。