鼠李糖乳杆菌影响仔猪肠道屏障功能的研究

摘要

鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）是一种被广泛应用的益生菌，因其具有改善宿主肠道健康、促进生长、降低腹泻及免疫调节等作用而备受关注。但有关鼠李糖乳杆菌对仔猪肠道屏障功能的影响及其机理研究较少。本论文通过体内和体外试验研究鼠李糖乳杆菌LR6001对仔猪肠道屏障功能的影响及可能的作用机理。主要的研究内容和结果如下:
　　 试验1:鼠李糖乳杆菌LR6001对哺乳仔猪肠黏膜屏障的影响及机理研究。随机选取6窝杜长大外三元初生仔猪24头，分为2个组，每组3窝。在仔猪出生后开始吮吸母乳前，经口灌服10％的灭菌脱脂乳溶液（对照组）或含鼠李糖乳杆菌LR6001(5～6×108 CFU/mL)的10％灭菌脱脂乳溶液（鼠李糖乳杆菌组），灌服量为2mL/（头·天），之后每2天灌服1次，共3次。由母猪按常规哺乳至25日龄，母猪和乳猪饲料均不添加抗生素，并在断奶前屠宰取样。结果显示，与对照组相比，鼠李糖乳杆菌组哺乳仔猪的日增重提高14.68％（P＜0.05），腹泻率下降30.73％（P＜0.05）;肠道菌群多样性增加，厚壁菌的比例显著增加，拟杆菌、变形菌和梭杆菌的比例都明显减少，显著降低了盲肠内容物中肠杆菌的数量（P＜0.01）;空肠绒毛高度:隐窝深度降低了10.01％(P＜0.05)，但绒毛长度差异不显著(P＞0.05)，隐窝深度的比值增加了20.13％(P＜0.05);空肠黏膜OCLN基因表达下调了48.12％(P＜0.05)，但ZO-1基因表达无显著差异（P＞0.05）;空肠黏膜的pBD-1和PMAP-37二种抗菌肽基因表达显著上调(P＜0.05)，LYS基因表达极显著下调（P＜0.01），MUC2基因表达和胃肠道pH值差异不显著（P＞0.05）;回肠黏膜DAO活性和ITF含量分别增加了375.15％（P＜0.01）和100.44％(P＜0.01)，空肠黏膜DAO活性和ITF含量分别降低了60.51％（P＜0.01）和33.98％（P＜0.01），表明小肠完整性得到改善;空肠黏膜麦芽糖酶活性提高41.29％（P＜0.05），回肠黏膜SIgA和C3的含量分别增加了25.70％(P＜0.05)和37.54％(P＜0.05)，空肠黏膜IgG、C3和SIgA的含量和回肠黏膜IgG含量略有提高（P＞0.05）;空肠黏膜的抗炎因子TGF-β1、IL-10、促炎因子IFN-γ和回肠黏膜的抗炎因子TGF-βI分泌极显著增加(P＜0.01)，空肠和回肠黏膜的促炎因子IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α的分泌都极显著降低(P＜0.01)，趋化因子IL-8也显著降低（P＜0.05），空肠黏膜的促炎因子TNF-α、IFN-γ、趋化因子MCP-1和抗炎因子TGF-β1的基因表达都显著上调（P＜0.01），说明空肠黏膜免疫功能得到提高;空肠黏膜的信号传导途径相关分子MD-2、TLR2、TLR9和TRAF6基因表达分别上调了21.29％(P＜0.05)、230.77％(P＜0.01)、107.34％(P＜0.01)和81.92％(P＜0.05)。
　　 试验2:鼠李糖乳杆菌LR6001对断奶仔猪小肠黏膜屏障的影响。试验1的仔猪于25日龄断奶，之后的一周内（至32日龄）继续饲喂教槽料，屠宰取样。结果表明，与对照组相比，鼠李糖乳杆菌组断奶仔猪腹泻率降低15.32％(P＞0.05)，日增重略有提高但差异不显著（P＞0.05）;肠道菌群多样性增加，厚壁菌数量显著增加，拟杆菌和变形菌的数量明显减少，肠道菌群结构得到改善;空肠黏膜结构形态比较完整，绒毛高度与隐窝深度的比值、绒毛长度分别极显著增加了34.93％(P＜0.01)和13.92％（P＜0.01），隐窝深度降低了14.53％(P＜0.05);胃的pH值显著下降;空肠黏膜的DAO含量下降21.77％（P＜0.01），而ITF和血清内毒素的含量没有显著变化(P＞0.05);空肠黏膜的乳糖酶活性下降13.60％（P＜0.05），而蔗糖酶和麦芽糖酶的活性无显著差异(P＞0.05);空肠黏膜sIgA的含量增加50％(P＜0.01)，IgG和C3含量则差异不显著(P＞0.05);空肠黏膜抗炎因子TGF-β1和促炎因子TNF-α含量都极显著提高（P＜0.01），促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12和IFN-γ的水平则极显著降低(P＜0.01)，趋化因子IL-8的含量显著降低（P＜0.05），抗炎因子IL-10的分泌量略有提高但差异不显著(P＞0.05)。
　　 试验3:鼠李糖乳杆菌LR6001对猪肠上皮细胞IEPC-J2 TLR基因表达影响的研究。将培养的IEPC-J2细胞分为4组，对照组(CK)、处理组Ⅰ(T6)、处理组Ⅱ(T7)和处理组Ⅲ(T8)分别添加鼠李糖乳杆菌(约0、106、107、108CFU/mL)。IEPC-J2细胞培养3h时收集细胞，采用实时荧光定量PCR方法分别测定TLR2、TLR4、TLR6、TLR9、TLR10的基因表达量。结果发现，与对照组相比，T6组TLR基因表达无显著变化（P＞0.05），T7组TLR6及T8组TLR2（P＜0.01）和TLR9(P＜0.01)基因表达量显著增加，TLR4显著降低（P＜0.01）;T6和T7组TLR2和TLR9基因表达上显著低于T8(P＜0.01)，但TLR4基因表达显著高于T8(P＜0.01)，T7组TLR10基因表达显著少于T8(P＜0.05)。结果提示，不同浓度的鼠李糖乳杆菌LR6001对IPEC-J2细胞TLR基因表达调控不同。
　　 综上可见，口服鼠李糖乳杆菌LR6001能够通过促进肠道微生态平衡，增强肠黏膜物理屏障、化学屏障以及免疫屏障功能来改善肠道健康促进仔猪断奶前后的生长并减少腹泻，其对哺乳仔猪肠黏膜免疫功能的调控可能是通过TLR信号途径介导而调控的。

目录

声明

论文说明

致谢

前言

摘要

主要英文缩略词

第一章 文献综述

1．1 益生菌的定义

1．2 益生菌的分类

1．3 益生菌在养猪生产中的应用

1．3．1 对猪生产性能及腹泻的影响

1．3．2 对猪血液生化指标的影响

1．3．3 促进机体新陈代谢

1．3．4 预防疾病

1．3．5 改善养殖环境

1．3．6 改善肉的品质

1．3．7 抗氧化作用

1．3．8 提高疫苗的抗体效价

1．4 益生菌对机体肠道屏障的调节作用

1．4．1 益生菌对肠道黏膜物理屏障的调节作用

1．4．2 益生菌对肠道黏膜化学屏障的调节作用

1．4．3 益生菌对肠道黏膜微生物屏障的调节作用

1．4．4 益生菌对肠道黏膜免疫屏障的调节作用

1．5 益生菌对Toll样受体的调节作用

1．5．1 模式识别分子

1．5．2 TLR种类及功用

1．5．3 TLR信号通路

1．5．4 肠黏膜与TLR的关系

1．5．5 益生菌对TLR表达影响

1．6 鼠李糖乳杆菌特性及其益生作用机理研究进展

1．6．1 鼠李糖乳杆菌特性

1．6．2 鼠李糖乳杆菌在动物上的应用

1．6．3 鼠李糖乳杆菌的益生作用机理

1．7 小结

第二章 鼠李糖乳杆菌LR6001对哺乳仔猪肠黏膜屏障功能的影响及机理研究

引言

2．1 材料与方法

2．1．1 试验动物

2．1．2 益生菌菌株

2．1．3 主要试剂

2．1．4 仪器设备

2．1．5 鼠李糖乳杆菌活菌制备

2．1．6 动物分组

2．1．7 饲养试验和日常管理方法

2．1．8 样品采集

2．1．9 指标检测方法

2．1．10 空肠基因表达

2．1．11 数据处理

2．2 结果

2．2．1 鼠李糖乳杆菌LR6001对哺乳仔猪生长和腹泻率的影响

2．2．2 鼠李糖乳杆菌LR6001对哺乳仔猪肠道微生物屏障的影响

2．2．3 鼠李糖乳杆菌LR6001对哺乳仔猪小肠黏膜物理屏障功能的影响

2．2．4 鼠李糖乳杆菌LR6001对哺乳仔猪小肠黏膜化学屏障的影响

2．2．5 鼠李糖乳杆菌LR6001对哺乳仔猪小肠黏膜免疫屏障的影响

2．2．6 鼠李糖乳杆菌LR6001对哺乳仔猪空肠黏膜先天免疫信号传导途径的影响

2．3 讨论

2．3．1 鼠李糖乳杆菌LR6001对哺乳仔猪生长和腹泻发生率的影响

2．3．2 鼠李糖乳杆菌LR6001对哺乳仔猪肠道微生物屏障的影响

2．3．3 鼠李糖乳杆菌LR6001对哺乳仔猪肠黏膜物理屏障的影响

2．3．4 鼠李糖乳杆菌LR6001对哺乳仔猪肠黏膜化学屏障的影响

2．3．5 鼠李糖乳杆菌LR6001对哺乳仔猪肠黏膜免疫屏障的影响

2．3．6 鼠李糖乳杆菌LR6001对哺乳仔猪空肠黏膜先天免疫信号传导通路的影响

2．4 小结

第三章 鼠李糖乳杆菌LR6001对断奶仔猪小肠黏膜屏障功能的影响

引言

3．1 材料与方法

3．1．1 试验动物

3．1．2 鼠李糖乳杆菌种

3．1．3 主要试剂

3．1．4 主要仪器设备

3．1．5 鼠李糖乳杆菌制剂的制备

3．1．6 动物分组

3．1．7 饲养试验和日常管理方法

3．1．8 样品采集

3．1．9 指标检测

3．1．10 数据处理

3．2 结果

3．2．1 鼠李糖乳杆菌LR6001对断奶仔猪生长和腹泻率的影响

3．2．2 鼠李糖乳杆菌LR6001对断奶仔猪肠道微生物屏障的影响

3．2．3 鼠李糖乳杆菌LR6001对断奶仔猪小肠黏膜绒毛结构和形态的影响

3．2．4 鼠李糖乳杆菌LR6001对断奶仔猪肠道化学屏障的影响

3．2．5 鼠李糖乳杆菌LR6001对断奶仔猪空肠黏膜免疫屏障的影响

3．3 讨论

3．3．1 鼠李糖乳杆菌LR6001对断奶仔猪生产性能和腹泻的影响

3．3．2 鼠李糖乳杆菌LR6001对断奶仔猪肠道微生物屏障的影响

3．3．3 鼠李糖乳杆菌LR6001对断奶仔猪小肠黏膜绒毛形态结构的影响

3．3．4 鼠李糖乳杆菌LR6001对断奶仔猪肠道化学屏障的影响

3．3．5 鼠李糖乳杆菌LR6001对哺乳仔猪小肠黏膜免疫屏障的影响

3．4 小结

第四章 鼠李糖乳杆菌LR6001对猪肠上皮细胞TLR基因表达影响的研究

引言

4．1 材料和方法

4．1．1 试验试剂

4．1．2 主要仪器设备

4．1．3 细菌培养

4．1．4 细胞培养

4．1．5 猪肠上皮细胞细胞处理

4．1．6 猪肠上皮细胞基因表达

4．1．7 数据分析

4．2 结果

4．2．1 鼠李糖乳杆菌LR6001对猪肠上皮细胞TLR2 mRNA表达水平的影响

4．2．2 鼠李糖乳杆菌LR6001对猪肠上皮细胞TLR4 mRNA表达水平的影响

4．2．3 鼠李糖乳杆菌LR6001对猪肠上皮细胞TLR6 mRNA表达水平的影响

4．2．4 鼠李糖乳杆菌LR6001对猪肠上皮细胞TLR9 mRNA表达水平的影响

4．2．5 鼠李糖乳杆菌LR6001对猪肠上皮细胞TLR10 mRNA表达水平的影响

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 提示、创新点和展望

5．1 提示

5．2 创新点

5．3 后续研究展望

参考文献

作者简历