l(3)03670基因在果蝇神经干细胞不对称分裂中的分子机制研究

摘要

干细胞不对称分裂能够完成干细胞的两个使命:自我更新和分化。自我更新保持干胞自身数目;分化则产生不同类型的子细胞确保组织、器官结构和功能的多样性。果蝇成神经细胞(Neuroblasts)也被称为神经干细胞(NeuralStemCells)，它们具有干细胞的这种特性。加之果蝇作为模式生物的众多优点，使得果蝇神经干细胞已经成为近年来研究干细胞不对称分裂的理想模型之一。
　　 干细胞自我更新和分化的平衡对生物体正常的生长发育至关重要。干细胞过度自我更新（只增殖不分化）会导致肿瘤形成;干细胞过度分化或者干细胞自我更新受阻则会导致干细胞池损耗，影响发育。由此可知，干细胞不对称分裂是一个高度精密控制的过程。在果蝇中已知PAR复合物(包含PAR-3(Bazooka)，PAR-6，atypicalProteinKinaseC(aPKC))与果蝇神经干细胞极性和细胞命运决定因子分布有关，并且调控神经干细胞自我更新，Gαi/Pins/Mud复合物参与纺锤体定向组装等。但是，干细胞如何调控自我更新和分化平衡的具体分子遗传机制仍然模糊。
　　 在果蝇中利用GAL4-UAS系统可组织特异性地驱动某基因RNAi发夹结构的表达，这样可以组织特异性地降低该基因的表达。我们利用此方法筛选与神经干细胞不对称分裂有关的基因。我们筛选到了参与调控果蝇神经干细胞自我更新的基因:lethal(3)03670(CG1715)。lethal(3)03670基因（简称l(3)基因）在果蝇神经干细胞中有表达。l(3)致死性突变l(3)268的纯合突变体死于二龄幼虫时期;l(3)268纯合突变体幼虫大脑神经干细胞细胞周期受到影响;l(3)268纯合突变体神经干细胞MARCM克隆出现神经干细胞缺失的现象，且突变体克隆明显比野生型小。由此可见，l(3)通过控制果蝇神经干细胞的细胞周期进程来调控神经干细胞自我更新。

目录

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致谢

摘要

缩写词

1 绪论

1．1 模式生物果蝇

1．2 果蝇中的干细胞

1．2．1 果蝇胚胎神经干细胞

1．2．2 果蝇幼虫神经干细胞

1．2．3 果蝇中的其他干细胞

1．3 不对称分裂

1．4 果蝇神经干细胞不对称分裂机制

1．4．1 果蝇神经干细胞极性

1．4．2 纺锤体定向组装

1．4．3 细胞命运决定因子的不对称分布

1．5 果蝇神经干细胞不对称分裂缺陷与肿瘤发生

1．6 果蝇神经干细胞不对称分裂与细胞周期

2 材料与方法

2．1 分子生物学实验

2．1．1 DNA实验

2．1．2 RNA实验

2．2 果蝇实验

2．2．1 果蝇的基本操作

2．2．2 实验中所用到的果蝇品系

2．2．3 果蝇中的RNAi Knock down

2．2．4 同源重组

2．2．5 MARCM产生神经干细胞克隆

2．2．6 解剖幼虫获得大脑

2．2．7 胚胎固定

2．3 生化试验

2．3．1 Western Blot

2．3．2 免疫荧光染色

2．4 抗L(3)兔免疫血清的制备

2．4．1 GST-L(3)融合蛋白表达

2．4．2 蛋白表达条件

2．4．3 蛋白大量表达

2．4．4 融合蛋白收集与纯化

2．4．5 抗体生产(兔免疫抗体)

2．5 实验中所用溶液

3 实验结果

3．1 引言

3．2 通过RNAl筛选到与神经干细胞不对称分裂相关的基因

3．3 基因lethal(3)03670

3．4 l(3)基因的突变等位基因l(3)

3．5 l(3)基因在神经干细胞细胞质中有表达

3．6 l(3)268纯合突变体胚胎神经干细胞表型

3．7 l(3)基因调控神经干细胞细胞周期进程

3．8 降低l(3)基因表达后大脑中神经干细胞数目减少

3．9 降低l(3)基因表达后大脑EdU染色

3．10 l(3)基因与神经干细胞细胞周期和自我更新有关

3．10．1 l(3)268纯合突变体神经干细胞克隆缺失Dpn+神经干细胞

3．10．2 l(3)268纯合突变体神经干细胞克隆含有更少的后代细胞

3．11 在野生型中过表达l(3)基因无异常表型

4 讨论

4．1 l(3)调控神经干细胞细胞周期进程

4．2 保持干细胞池的大小需要l(3)基因

4．3 l(3)基因促进神经干细胞自我更新

4．4 l(3)基因将来的研究方向

参考文献

个人简历