利用RNAi技术抑制褐飞虱蔗糖酶基因和蔗糖转运子基因的研究

摘要

褐飞虱(Nilaparvata lugens(St(a)l)）属同翅目(Homoptera)飞虱科(Dekphacidae)，是我国及许多亚洲国家稻区的主要害虫。目前，防治褐飞虱的主要方法是化学防治。但是，长时间使用化学农药带来了农药残留，环境污染和害虫产生抗药性等问题。RNA干扰（RNA interference，RNAi）近年来迅速发展，广泛应用于基因功能确定、基因敲除、抗癌症和病毒病药物研究等方面的研究，也为病虫害防治提供了一个新的方向。
　　本论文选取了4个褐飞虱生理活动相关基因作为靶标基因。基于RNAi技术构建了RNA干扰载体并转化水稻，获得了4种能分别表达各自靶标dsRNA的转基因植株。其中，2个靶标基因是褐飞虱蔗糖酶基因（命名为145、282），2个是蔗糖转运子基因（命名为303、246）。
　　本论文采用玉米泛素启动子（Zea maypolyubiquitin-1 promoter, ZmUbi）指导dsRNA表达，用抗草甘膦基因G10evo(5-烯酮式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，EPSPS)作为筛选标记，构建dsRNA的表达载体。利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转化的方法将表达载体分别转化粳稻品种“秀水134”，获得了表达各自靶标基因dsRNA的抗草甘膦转基因水稻。
　　在T0代转基因植株（145基因17株、282基因15株、303基因15株、246基因13株）的褐飞虱生物活性测定中，实验组褐飞虱数量与对照组并没有明显差异。虽然虫体死亡或数量减少，但大多为接虫时的机械损伤或褐飞虱逃逸所致，转基因植株相较对照组并没有表现出褐飞虱抗性。在T0代145、282、303、246转基因植株中，每个基因选取7个株系的种子进行发芽，并在水稻5叶期喷施200倍的草甘膦筛选阳性转基因植株。用Northern Blot的方法对阳性植株的dsRNA表达情况进行检测，结果表明每个基因中均有dsRNA表达量较高的株系存在（145基因为4、7号，282基因为1、3、7号，303基因为4、6号，246基因为2、5、7号）。根据Northern Blot的结果，每个基因选取3个dsRNA表达量最高的株系进行褐飞虱生物活性测定，结果发现，转基因水稻并没有表现出明显的褐飞虱抗性。对转基因水稻T1代植株进行Northern Blot实验，发现T1代植株可以表达靶标基因的dsRNA。这说明转基因水稻表达dsRNA这一性状能稳定地遗传至T1代，但是转基因水稻T0和T1代都没有表现出明显的褐飞虱抗性，这可能是由于植株内dsRNA浓度太低、摄取过程中dsRNA被降解或无法运输至靶标位点、有其他基因代替被降解的靶标基因发挥作用等原因所致。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 褐飞虱简介及其危害

1．1．1 褐飞虱简介

1．1．2 褐飞虱危害

1．2 褐飞虱防治方法

1．2．1 抗性品种选育

1．2．2 化学防治

1．2．3 生物防治

1．2．4 健壮栽培

1．2．5 物理防治

1．2．6 转基因技术防治

1．3 RNAi简介及在昆虫防治中的应用

1．3．1 RNA干扰的作用机理

1．3．2 RNAi的特点

1．3．3 昆虫RNAi的发现及定义

1．3．4 dsRNA吸收机制

1．3．5 昆虫中RNAi实现方法

1．3．6 RNAi在害虫防治中的应用

1．3．7 影响RNAi效果的因素

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株

2．1．2 动植物材料

2．1．3 质粒载体

2．1．4 试剂盒及核酸标准

2．1．5 主要酶类

2．1．6 其他试剂

2．1．7 仪器

2．2 方法

2．2．1 分子生物学方法

2．2．2 农杆菌介导的外源基因水稻转化方法

2．2．3 转基因水稻褐飞虱生物活性检测方法

3 干扰载体构建及水稻转化检测

3．1 干扰戴体构建

3．1．1 褐飞虱RNA的提取及cDNA的合成

3．1．2 褐飞虱基因145、282、303、246干扰片段的克隆

3．1．3 干扰片段T-Easy载体构建

3．1．4 干扰载体的构建

3．2 水稻转化及后期检测

3．2．1 水稻转化

3．2．2 T0代转基因水稻褐飞虱生物活性测定

3．2．3 T1代转基因水稻后期检测

4 结果与分析

4．1 基因145、282、303、246干扰片段的获得

4．2 干扰片段T-Easy载体构建

4．3 干扰载体的构建

4．4 水稻转化

4．5 T0代转基因水稻褐飞虱生物活性测定

4．6 T1代转基因水稻Northern blot

4．7 T1代转基因水稻的褐飞虱生物活性测定

5 讨论

参考文献

作者简历

附录