缺铁响应转录因子OsbHLH133的功能和缺铁诱导乙烯合成分子机理的研究

摘要

铁是植物生长所必需的微量元素。土壤中的铁含量丰富，但铁在土壤中的低溶解性使得它能被植物吸收利用的部分极少，同时过量的铁素也会造成植物铁中毒。研究植物的缺铁响应分子机制，对植物适应缺铁和铁过量等环境逆境，培育优良富铁品种等具有重要的意义。
　　 本研究在水稻中克隆了一个碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）家族的转录因子——OsbHLH133。OsbHLH133定位在细胞核中，在根中受缺铁强烈诱导，通过对启动子接GUS报告基因的转基因株系的GUS活性分析，发现缺铁时OsbHLH133主要在整个根部细胞，特别是中柱以及地上部分的维管组织中表达。系统进化树表明，在进化上，OsbHLH133与拟南芥、水稻和番茄中已被报道的参与缺铁响应分子机制的bHLH转录因子位于不同的分支中，表明OsbHLH133极有可能具有不同于已知的铁相关的bHLH蛋白的新功能。
　　 通过对OsbHLH133超表达转基因植株(OsbHLH133-OE)和T-DNA插入突变体（bhlh133）的研究，发现缺铁时bhlh133突变体叶片叶绿素含量（SPAD）上升，而OsbHLH133-OE植株的SPAD值下降。与野生型植株相比，突变体植株的地上部分铁含量升高，而根中铁含量降低。OsbHLH133-OE植株的铁含量测定结果与之相反，即地上部分铁含量降低，而根中铁含量上升。此外，OsbHLH133-OE植株木质部液中的铁含量也低于野生型。由此可见，OsbHLH133参与调控铁素在水稻地上部分和根中的分布。
　　 基因芯片结果结合定量RT-PCR分析表明，缺铁响应基因在根和叶中的表达与铁含量相关联，即铁含量高的组织，缺铁响应基因的表达低，铁含量低的组织，基因的表达被诱导，缺铁响应基因的表达直接反应了植株的局部铁含量水平。另外，芯片分析结果显示有很多信号通路相关的基因在突变体和野生型根中的表达具有显著差异，这些基因包括钙离子信号通路中的相关基因，说明了钙离子信号在植物的铁平衡过程中可能发挥作用。
　　 本研究旨在完善植物缺铁响应信号途径的理论基础，缺铁诱导乙烯合成也是植物响应缺铁的一种表现，本论文初步开展了缺铁诱导乙烯合成的分子机理研究。通过对拟南芥中的9个有ACC合成酶功能的ACS基因的表达分析，发现AtACS2/6/7/11不论在叶中还是在根中都受到缺铁显著诱导，这表明了拟南芥中这几个ACS基因很可能参与缺铁诱导乙烯合成这个过程中。此外，AtACS2/6的上游调控蛋白AtMPK3/6的转录表达也受缺铁诱导。
　　 不同缺铁时间的乙烯含量分析表明，缺铁诱导拟南芥的乙烯合成，而诱导倍数最高为1.7-2倍。由于拟南芥ACS家族基因功能冗余严重，我们无法在供缺铁乙烯含量仅2倍的差异条件下，通过ACS基因相关突变体的乙烯含量测定来筛选负责缺铁诱导乙烯合成的ACS基因。通过对拟南芥mpk3和mpk6突变体乙烯含量的测定，发现缺铁时，mpk6植株的乙烯合成量显著低于野生型，而mpk3的乙烯合成量也有所降低，但不显著，这表明AtMPK6很可能参与调控缺铁诱导乙烯合成这个过程。
　　 综上所述，本论文对水稻OsbHLH133转录因子进行了研究，发现OsbHLH133的表达受缺铁强烈诱导，功能研究表明OsbHLH133调控着铁在水稻地上部分和根部的分布，很有可能参与调控铁在木质部中的长距离运输。通过对拟南芥AtACS基因，AtMPK基因相关突变体的研究，本论文初步确定了参与缺铁诱导乙烯合成的ACS基因，而AtMPK6可能参与调控这个过程。

目录

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论文说明

致谢

缩略语表

摘要

第一章 文献综述

1．1 铁的吸收

1．1．1 铁吸收机制-还原机制(机制Ⅰ)

1．1．2 铁吸收机制-整合机制(机制Ⅱ)

1．2 铁的转运

1．2．1 铁在木质部中的转运

1．2．2 铁在韧皮部中的转运

1．2．3 亚细胞中的铁转运

1．3 铁信号调控

1．3．1 碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族

1．3．2 铁信号调控-还原机制

1．3．3 铁信号调控-整合机制

1．4 调控缺铁响应的信号分子

1．4．1 植物激素乙烯与缺铁信号

1．4．2 其它参与调控缺铁响应信号的激素与小分子物质

1．5 本研究的目的意义及主要内容

第二章 材料方法

2．1 实验材料

2．1．1 OsbHLH133转录因子的功能研究

2．1．2 缺铁诱导乙烯合成分子机理的研究

2．2 实验方法

2．2．1 植物生长条件

2．2．2 表达载体的构建和突变体的鉴定

2．2．3 农杆菌介导的水稻转化

2．2．4 进化树分析

2．2．5 OsbHLH133的亚细胞定位

2．2．6 GUS(β-glucuronidase)染色及切片分析

2．2．7 SPAD值测定

2．2．8 水稻木质部液收集及样品处理

2．2．9 金属元素含量测定

2．2．10 拟南芥乙烯含量测定

2．2．11 三价铁还原酶(Ferric-chelate Reductase)活性测定

2．2．12 基因表达分析

第三章 缺铁响应转录因子OsbHLH133的功能研究

3．1 结果与分析

3．1．1 OsbHLH133的序列分析

3．1．2 OsbHLH133的亚细胞定位

3．1．3 OsbHLH133的表达模式

3．1．4 突变体及超表达材料的鉴定

3．1．5 突变体和超表达株系的生长状况

3．1．6 铁含量的测定

3．1．7 基因表达分析

3．2 讨论

第四章 缺铁诱导乙烯合成分子机理的研究

4．1 结果与分析

4．1．1 拟南芥、水稻和玉米ACS蛋白的结构及进化分析

4．1．2 拟南芥ACS基因、MPK基因在供缺铁条件下的表达模式

4．1．3 拟南芥野生型和突变体植株乙烯含量的测定

4．1．4 拟南芥acs2／6，acs1／2／4／5／6／7／9／11突变体的生理数据

4．1．5 缺铁响应基因在acs2／6和acs1／2／4／5／6／7／9／11突变体中的表达

4．2 讨论

第五章 结论与展望

5．1 OsbHLH133参与调控铁在水稻地下和地上部分的分布

5．2 缺铁诱导乙烯合成分子机理的研究

参考文献

攻读博士期间发表的论文