红肉和白肉枇杷果实类胡萝卜素差异积累机制研究

摘要

枇杷（Eriobotrya japonica）根据果肉颜色可分为红肉和白肉两大类，类胡萝卜素为其主要呈色色素，本文主要以红肉枇杷‘洛阳青’和白肉枇杷‘白沙’为研究对象，探索两类枇杷果实类胡萝卜素差异积累的分子生理机制。主要结果如下: 1、对7个红肉和7个白肉枇杷品种成熟果实的类胡萝卜素含量和组成进行了分析。两类枇杷含量存在显著差异，红肉品种果皮(68.04～137.8μg/g FW)明显高于白肉品种(16.12～61.81μg/g FW)，前者平均含量为后者的2.9倍;红肉枇杷果肉(9.16～20.52μg/g FW)远高于白肉枇杷(0.21～1.09μg/g FW)，前者平均含量为后者的26.6倍。两类枇杷的类胡萝卜素组成也不相同，以β-胡萝卜素占总类胡萝卜素的比例为例，红肉品种果皮(63.92％)和果肉(31.85％)要高于白肉品种果皮(50.57％)和果肉(11.92％);而叶黄质占总类胡萝卜素的比例则相反，白肉品种果皮(14.72％)和果肉(9.06％)较红肉品种果皮(5.3％)和果肉(0.47％)高。 2、以‘洛阳青’和‘白沙’成熟果肉为对象开展了抑制性消减杂交(SSH)，但未获得类胡萝卜素代谢基因，暗示品种间基因表达强度差异较小。利用简并引物从‘洛阳青’枇杷果肉中同源克隆了类胡萝卜代谢途径关键基因，进而开展了基因表达分析，发现‘洛阳青’果实发育期间类胡萝卜素含量变化与类胡萝卜素代谢相关基因的表达模式呈现良好的相关性。转色期后八氢番茄红素合成酶EjPSY1和有色体特异番茄红素β环化酶EjCYCB在‘洛阳青’果皮的表达强度为‘白沙’果皮的2倍左右，与‘洛阳青’类胡萝卜素含量高于‘白沙’相一致。但‘洛阳青’和‘白沙’果肉类胡萝卜素代谢基因表达强度差异不大（不超过2倍），难以解释果肉间50倍的差异，暗示存在另外机制导致两类枇杷间果肉类胡萝卜素积累的巨大差异。 3、对不同品种的EjPSY1序列进行了分析，发现在成熟果实中特异表达的EjPSY1成员在‘白沙’中存在序列缺失突变，突变序列mRNA长度为861 bp，比正常mRNA序列短333 bp，导致终止密码子提前而不能翻译成正常的PSY蛋白质，少了110个氨基酸，并在经分析的另外六个白肉品种中均发现同样的序列突变。进一步分析表明，这一缺失突变在DNA水平上就已存在。尽管EjPSY1发生的序列突变并不影响其表达强度及组织表达模式，但EjPSY1序列的缺失突变可导致其酶催化功能丧失，使白肉枇杷成熟果肉不能积累类胡萝卜素。‘大五星’、‘宝珠’和‘大红袍’这3个红肉品种除了存在正常的EjPSY1序列，同时也存在EjPSY1突变序列，推测控制这3个品种果肉颜色的基因是杂合型。进一步对‘洛阳青’和‘白沙’枇杷成熟果实深度测序库序列进行分析，发现枇杷中还存在另外两个成员EjPSY2和EjPSY3，对其组织特异性表达进行分析表明，EjPSY2在果皮和果肉中只有微弱表达，仅为叶片中表达强度的1％左右，EjPSY2在白肉品种叶片中的表达使得叶片也能正常合成类胡萝卜素;EjPSY3在根、茎、叶和果皮中都有表达，白肉枇杷成熟果皮可积累一定量的类胡萝卜素与EjPSY3在果皮中表达相关。 4、类胡萝卜素差异积累的‘洛阳青’和‘白沙’果实细胞中的质体结构也存在明显差异。脂质小球的数量及发育程度在‘洛阳青’果实中要高于‘白沙’果实，在‘白沙’果肉中很难发现脂质小球结构。质体脂质相关蛋白(PAP)的表达强度在‘洛阳青’果实转色期后大量增长，而在‘白沙’果实中一直维持比较低的水平。进一步对‘洛阳青’和‘白沙’成熟果肉有色体进行了蛋白质组学差异分析，发现类胡萝卜素合成途径上的酶蛋白的丰度不存在显著差异。 综上所述，EiPSY1在白肉枇杷中的序列缺失突变造成其果肉不能正常积累类胡萝卜素，EjPSY2和EjPSY3的表达使白肉枇杷叶片和果皮等组织积累类胡萝卜素。红肉枇杷和白肉枇杷果实质体结构和发育程度存在显著差异，其中PAP基因在白肉枇杷中的低表达可能影响其质体结构中脂质小球的发育。

目录

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致谢

摘要

缩略语表

1 绪论

1．1 植物类胡萝卜素合成与积累

1．1．1 类胡萝卜素及其功能

1．1．2 植物类胡萝卜素合成途径

1．2 类胡萝卜素在植物品种间差异积累机制

1．2．1 类胡萝卜合成基因表达差异

1．2．2 类胡萝卜素合成基因突变与序列差异

1．2．3 类胡萝卜素降解能力的差异

1．2．4 质体发育相关基因表达在种间品种间的差异

1．2．5 非类胡萝卜素合成途径的基因变异调控

1．3 研究目标与内容

2 枇杷不同品种和不同发育阶段果实类胡萝卜素分析

2．1 实验材料和方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 果实色泽测定

2．1．3 类胡萝卜素提取和测定

2．2 结果

2．2．1 品种间果实色泽存在差异

2．2．2 品种间果实品种间类胡萝卜素含量与组成存在差异

2．2．3 果实发育阶段类胡萝卜素含量变化

2．3 讨论

3 枇杷类胡萝卜素代谢相关基因表达研究

3．1 实验材料和方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 抑制性消减杂交(SSH)技术

3．1．3 类胡萝卜素代谢基因克隆

3．1．4 类胡萝卜素代谢基因表达

3．2 结果

3．2．1 ‘洛阳青’和‘白沙’消减文库DNA序列的分析

3．2．2 类胡萝卜素相关基因克隆分析

3．2．3 类胡萝卜素相关基因在两个品种果实生长发育进程中的表达

3．3 讨论

4 枇杷品种间PSY突变序列及成员分析

4．1 实验材料和方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 RNA-Seq库序列提取

4．1．3 利用RACE技术分离全长

4．1．4 基因表达

4．1．5 启动子序列分离及分析

4．2 结果

4．2．1 PSY成员全长序列克隆和分析

4．2．2 PSY成员组织特异性表达分析

4．2．3 PSY成员果实发育阶段表达

4．2．4 PSY成员启动子分析

4．3 讨论

5 两类枇杷质体结构和有色体蛋白组差异分析

5．1 实验材料和方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 果实质体光学显微观察

5．1．3 果实质体超微结构观察

5．1．4 Or和PAP克隆及表达分析

5．1．5 采用iTRAQ技术分析‘洛阳青’和‘白沙’成熟果肉细胞有色体蛋白组差异

5．2 结果

5．2．1 质体发育显微观察

5．2．2 质体发育超微结构观察

5．2．3 Or和PAP基因表达分析

5．2．4 两类品种成熟果肉质体蛋白组差异(iTRAQ)分析

5．3 讨论

6 小结与展望

6．1 小结

6．2 展望

参考文献

作者简历及在学期间所取得的科研成果