斑马鱼中一个母源转录因子调控轴旁中胚层图式形成

摘要

胚胎形体模式形成中的轴-轴旁中胚层分化是脊椎动物特有的背腹分化事件。但轴-轴旁中胚层区域的划分不能用已知的，建立在合子信号梯度基础上的背腹分化机制来解释。在斑马鱼中，spt以细胞自主性方式调控轴旁中胚层分化，flh则通过抑制spt的异位表达而启动轴中胚层分化。但二者的最初表达区域在胚盘边缘区域是重叠的。因此，限定轴中胚层调控关键基因flh和轴旁中胚层发育调控关键基因spt的表达区域是轴-轴旁中胚层图式形成的前提条件。我们在前期工作发现转录因子Vsx1具有直接抑制flh表达而保护spt表达的功能。本研究进一步分析了Vsx1在调控斑马鱼轴-轴旁中胚层图式形成中的作用和分子机制，主要研究结果和结论如下:
　　 1.通过整胚免疫组织化学定位分析，证明了母源Vsx1在卵裂期即在胚胎预定的腹侧区域表达。
　　 2.利用特异性抑制转录的MO和抑制剪接的MO证明母源而非合子的vsx1mRNA在胚胎轴旁中胚层形成中起关键的调控作用。
　　 3.通过整胚原位杂交确定了母源Vsx1在腹侧区域通过抑制flh的表达而保护spt表达，从而确定轴旁中胚层区域。
　　 4.发现母源Vsx1对维持原肠期胚胎腹侧的特性也有重要作用，但对已知的维持胚胎腹部特性的Wnt8，Bmp2b信号途径没有影响，提示斑马鱼胚胎腹侧特性的维持可能受两个平行的途径调控。
　　 5.通过将Vsx1蛋白的N端区域分别用果蝇EngrailedN端的转录抑制结构域和病毒Vp16的转录激活结构域替换，分析En-Vsx1和VP16-Vsx1融合蛋白对胚胎发育表型的影响和对flh表达的影响，证明了Vsx1是一个转录抑制因子。
　　 6.通过突变分析，确定了Vsx1在flh近端启动子上的特异性结合位点，证明了只有该位点介导了Vsx1对flh的转录抑制。
　　 7.确定了Vsx1在靶基因启动上特异性结合位点的序列特性。通过突变分析证明了除homeodomain的结合基序TAATTN外，至少还有一个CCC序列是Vsx1特异性识别和结合靶点所必需的。CVC结构域也可能在Vsx1与DNA结合位点的特异性识别中起重要作用。
　　 这些结果证明了脊椎动物特有的轴—轴旁中胚层最初图式形成是由母源因子直接在转录水平调控。信号浓度梯度不是初始轴—轴旁中胚层图式形成的主要调控因素。所发现的特异性结合位点的序列特性和CVC功能对揭示paired-like转录因子的作用机制有重要意义。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 引言

1．1 背腹轴形成的分子机制

1．1．1 组织者的形成

1．1．2 腹部极性的形成也由母源因子主动调控

1．2 胚层分化与中胚层诱导的分子机制

1．2．1 胚层分化

1．2．2 中胚层诱导

1．3 中胚层的背腹区域图式形成

1．4 Wnt8a协同Bmp2b信号途径维持斑马鱼胚胎腹部的特性

1．4．1 Bmp2b在维持斑马鱼腹部特性中的作用

1．4．2 Wnt8通过激活vox／vent／ved以维持斑马鱼腹部的特性

1．5 轴和轴旁中胚层图式形成的调控机制尚不清楚

1．6 斑马鱼轴和轴旁中胚层特化基因的控制机制

1．6．1 Spadetail(Spt)在轴和轴旁中胚层分化中的作用

1．6．2 spt通过直接激活papc来影响细胞运动

1．6．3 flh能够抑制spt在轴中胚层的异位表达

1．6．4 ntl能够维持原肠期flh的表达

1．6．5 flh，spt之间的关系

1．7 vsx1的结构特性及其在胚胎发育过程中的作用

1．7．1 同源异型框基因的分类以及功能

1．7．2 Vsx1的结构特性

1．7．3 CVC结构域

1．7．4 斑马鱼vsx1的表达模式

1．7．5 vsx1的功能

1．8 本研究的目的和意义

第二章 母源Vsx1影响胚胎早期形体模式形成

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．1 溶液和试剂的配制

2．2．2 斑马鱼胚胎获取

2．2．3 斑马鱼胚胎脱膜处理

2．2．4 斑马鱼胚胎不同发育时期材料的获取

2．2．5 PCS107+vsx1载体的构建

2．2．6 Vsx1抗体的制备和检测

2．2．7 vsx1的在早期胚胎中的定位分析

2．3 实验结果

2．3．1 Vsx1抗体特异性

2．3．2 vsx1早期表达的定位

2．4 实验小结与讨论

第三章 母源Vsx1是轴旁中胚层特化所必需的转录调控因子

3．1 前言

3．2 材料和方法

3．2．1 溶液和试剂的配制

3．2．2 vsx1 sbMO的设计

3．2．3 重组质粒的构建

3．2．4 体外转录capped mRNA

3．2．5 反义RNA探针的制备

3．2．6 显微注射

3．2．7 整胚原位杂交

3．3 实验结果

3．3．1 母源vsx1 mRNA影响早期胚胎发育

3．3．2 母源Vsx1参与轴和轴旁中胚层细胞命运的决定

3．3．3 母源Vsx1启动轴旁中胚层特化

3．3．4 母源vsx1在调控flh，spt表达模式中的作用

3．3．5 Vsx1不影响Wnt8和Bmp2b信号通路

3．4 实验小结与讨论

第四章 Vsx1是转录抑制因子

4．1 前言

4．2 材料和方法

4．2．1 溶液和试剂的配制

4．2．2 重组En-vsx1和VP16-vsx1

4．2．3 体外转录

4．2．4 显微注射

4．2．5 原位杂交

4．2．6 qRT-PCR分析

4．3 实验结果

4．3．1 En-Vsx1和VP16-Vsx1的构建

4．3．2 En-Vsx1和VP16-Vsx1对发育和内源flh表达的影响

4．3．3 En-Vsx1和VP16-Vsx1对靶基因转录影响的定量分析

4．4 实验小结与讨论

第五章 Vsx1在DNA上结合位点的序列特性和识别功能域

5．1 前言

5．2 材料和方法

5．2．1 溶液和试剂的配制

5．2．2 斑马鱼基因组DNA的提取

5．2．3 构建GFP报告基因

5．2．4 显微注射

5．2．5 qRT-PCR定量分析Vsx1对gfp表达丰度的影响

5．2．6 构建表达载体

5．2．7 融合蛋白的表达以及纯化

5．2．8 凝胶阻滞实验的原理和方法

5．2．9 染色质免疫共沉淀

5．2．10 突变HD以及CVC结构域

5．3 实验结果

5．3．1 Vsx1特异性结合位点的序列特性

5．3．2 其他序列元件参与了Vsx1与靶基因特异性结合位点的识别

5．3．3 Vsx1能够结合到ntl启动子上具有相似序列特性的位点

5．3．4 vsx1 CVC区域的克隆以及序列优化

5．3．5 体外表达GST+CVC结构域

5．3．6 GST+CVC融合蛋白的纯化以及浓度测定

5．3．7 GST+CVC融合蛋白的鉴定

5．3．8 Vsx1的HD和CVC结构域突变都不能再抑制靶基因的表达

5．3．9 Vsx1的HD和CVC结构域突变都导致其不能与靶基因结合

5．3．10 Vsx1的CVC结构域不能在体外与结合位点直接结合

5．4 实验小结与讨论

第六章 主要结果，结论和进一步的研究设想

6．1 主要研究结果和结论

6．2 进一步研究'设想

参考文献