母源Vsx1对斑马鱼索前中内胚层和前脑形成的调控

摘要

脑是脊椎动物体内结构和功能最复杂的器官，它的发育涉及了一系列错综复杂的分子、细胞和形态发生程序和调控机制，揭示脊椎动物脑结构按照特定的时空模式形成的调控机制是神经发育生物学最具挑战的任务。所有脊椎动物脑的结构进化上是保守的，中枢神经系统的早期发育过程也是相似的。已有的研究表明，脊椎动物的前脑结构来源于前端神经外胚层细胞。位于胚胎内部的索前中内胚层(prechordal mesendoderm，PME)在前脑的特化和发育过程中起关键的诱导作用。特定形状和大小PME的形成，PME在胚胎上的定位而建立与外胚层正确的空间关系，对正常前脑图式的形成和发育，以及中枢神经系统前后模式的建立都至关重要。但是，目前关于调控PME正确形成和空间定位的分子机制还很不清楚。最近的实验工作发现在母源转录因子Vsx1功能被抑制的斑马鱼胚胎中，其脊索中胚层区域比对照的野生型胚胎中明显变短，提示母源Vsx1参与了斑马鱼胚胎前后图式形成的调节。为此，我们在斑马鱼中研究了母源Vsx1在调控PME形成和定位以及中枢神经系统发育中的作用;证明了母源Vsx1通过控制在正确的位置形成特定大小和形状的PME而在调控斑马鱼前脑的形成和定位中起关键作用。
　　本研究主要内容包括：⑴抑制母源Vsx1的功能严重阻碍PME形成和向前迁移，导致斑马鱼胚胎前脑结构的缺陷和空间位置的后移。这一结果说明母源Vsx1在调控胚胎PME和前脑形成和定位中起关键作用。⑵在母源Vsx1功能抑制胚胎中，通过注射dkk1 mRNA弥补因PME缺陷而导致的Wnt拮抗因子分泌不足，能诱导一个相对正常的前脑在靠后端的位置处形成。这一结果提示母源Vsx1不能直接调控前端神经外胚层前体细胞的命运特化，而是通过控制PME的形成和定位来间接调节前脑的形成和定位。⑶细胞形态变化的分析证明，Vsx1功能抑制胚胎在60％下包期，靠近上、下胚层边界处中内胚层最前端细胞不能像在野生型胚胎中一样朝动物极定向伸长，由此导致PME细胞不能朝动物极迁移。这些结果证明母源Vsx1通过保护预定PME细胞的定向伸长而调控PME的形成和定位。⑷功能缺失与获得实验结合整胚原位杂交和实时定量RT-PCR分析揭示了母源Vsx1是在胚胎发育早期抑制脊索中胚层关键发育调控基因ntl在靠近动物极区域异位表达所必须的抑制因子。⑸染色质免疫共沉淀实验结合核心序列突变分析进一步揭示了母源Vsx1通过结合到近端启动子上特定位点而直接抑制nrl的转录。⑹在抑制母源Vsx1功能的同时也抑制Ntl的功能，能使大部分胚胎中前脑的发育恢复正常，预定PME细胞的定向伸长、PME的形成和定位也恢复正常。相反，过表达ntl mRNA则造成斑马鱼前端发育缺陷。这些结果表明母源Vsx1功能抑制引起ntl在胚胎发育早期的异位表达，导致了PME和前脑的不正常发育和定位。综上所述，我们的研究揭示了一种在斑马鱼早期胚胎发育过程中由母源转录抑制因子控制正常PME和前脑形成和定位的机制：在胚胎发育早期，母源Vsx1通过直接转录抑制，限制ntl在更靠近动物极区域的表达；解除这种限制而导致的ntl在更靠近动物极区域的异位表达，将会抑制PME细胞向动物极伸长和定向迁移，从而严重扰乱PME和前脑的形成。这些研究结果深化了人们对前脑发育过程中错综复杂的分子、细胞和形态发生初始调控机制的理解。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 引言

1．1 脊椎动物脑的形成过程和基本结构

1．2 脊椎动物组织者的形成与胚胎神经诱导

1．2．1 组织者的形成的分子机制

1．2．2 脊椎动物神经诱导的分子机制

1．3 中枢神经系统前后模式形成的分子机制

1．3．1 Wnt信号途径

1．3．2 FGF信号途径

1．3．3 视黄酸(retinoic acid，RA)

1．4 Spemann组织者的不同功能区域

1．4．1 头部组织者(Head organizer)

1．4．2 躯干部组织者(Trunk organizer)

1．5 索前中内胚层在中枢神经系统前后模式形成中的作用

1．5．1 PME形成与维持的分子机制

1．5．2 PME在前端神经系统发育中的作用

1．5．3 PME调控中枢神经前后模式形成的分子机制

1．6 PME细胞的运动方式及其调控机制

1．6．1 原肠胚期中内胚层细胞的运动

1．6．2 PME细胞的运动方式

1．6．3 调节PME细胞运动的分子机制

1．7 调控PME正确形成和空间定位的分子机制还不清楚

1．8 不同中枢神经功能区域在神经外胚层前后图式建立中的作用

1．8．1 前端神经边缘(anterior neural border，ANB)

1．8．2 峡部组织者(isthmic organizer，IsO)

1．8．3 Zona limitans intrathalamica(ZLI)

1．8．4 菱脑节4(rhomobere 4)

1．9 转录因子Vsx1的特性及其在早期胚胎发育中的作用

1．9．1 脊椎动物中vsx1的结构特性及其时空表达模式

1．9．2 vsx1在脊椎动物发育过程中的功能研究

1．10 本研究的目的和意义

第二章 材料和方法

2．1 溶液的配置

2．2 斑马鱼的饲养以及胚胎的获得

2．3 斑马鱼胚胎去膜

2．4 反义吗啉环寡聚核苷酸(morpholino oligo，MO)的制备

2．5 Capped mRNA的制备

2．5．1 不同时期斑马鱼胚胎RNA的提取

2．5．2 RT-PCR

2．5．3 目的基因的扩增及回收

2．5．4 双酶切反应

2．5．5 连接及转化

2．5．6 重组载体的鉴定

2．5．7 重组载体的单酶切制备线性模板

2．5．8 Capped mRNA的制备与纯化

2．6 斑马鱼胚胎的显微注射

2．7 不同时期胚胎的观察与收集

2．8 整胚原位杂交

2．8．1 RNA探针的制备

2．8．2 斑马鱼的整胚原位杂交

2．8．3 差异标记共表达原位杂交

2．9 斑马鱼胚胎激光共聚焦观察

2．9．1 GAP43-YFP mRNA的制备

2．9．2 斑马鱼胚胎激光共聚焦(confocal)观察

2．10 实时荧光定量PCR

2．10．1 不同时期、注射不同试剂的斑马鱼胚胎RNA的提取

2．10．2 斑马鱼总RNA中残留的基因组DNA的去除

2．10．3 逆转录合成cDNA

2．10．4 实时定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)

2．11 GFP报告基因重组载体的构建

2．11．1 斑马鱼ntl近端启动子的扩增及重组质粒的构建

2．11．2 突变GFP报告基因载体的构建

第三章 实验结果

3．1 母源Vsx1参与调控PME形成和PME细胞的定向迁移

3．1．1 斑马鱼Vsx1对于PME的正确形成和空间定位是必需的

3．1．2 Vsx1调控PME细胞向前端的定向迁移运动

3．1．3 母源vsx1功能抑制胚胎中PME细胞形态发生了改变

3．2 母源Vsx1是斑马鱼胚胎前脑发育所必需的调控因子

3．2．1 母源vsx1影响斑马鱼胚胎神经系统早期发育

3．2．2 母源Vsx1特异性调控斑马鱼胚胎前脑的形成和空间定位

3．3 母源Vsx1功能抑制胚胎中PME形成和定位的缺陷导致了前脑的畸形发育和定位

3．4 母源Vsx1直接抑制ntl在胚胎发育早期的异位表达

3．3．1 vsx1调控ntl在原肠早期的表达

3．3．2 Vsx1在体内与以村启动子结合的ChIP分析

3．3．3 Vsx1在ntl启动子上结合位点的确定

3．3．4 母源Vsx1不影响ntl上游Wnt和FGF因子的表达

3．5 斑马鱼Vsx1通过抑制ntl的异位表达在PME形成和前脑发育中起关键调控作用

3．5．1 共注射ntl MO能够恢复PME的形成和PME细胞的定向迁移运动

3．5．2 共注射ntl MO可以拯救母源Vsx1功能抑制胚胎中的前脑发育缺陷

3．5．3 斑马鱼中广泛表达ntl mRNA会造成前端发育缺陷

3．5．4 干扰Wnt11的功能不能有效地拯救Vsx1功能抑制胚胎中PME细胞的定向迁移运动

第四章 总结，讨论及进一步研究的设想

4．1 本研究的主要结果和结论

4．2 讨论

4．2．1 防止bra／ntl错误表达可能是脊椎动物中PME形成和前脑图式形成的一种保守调控机制

4．2．2 在Ntl错误表达胚胎中可能因细胞粘附被干扰而阻断了预定PME细胞的迁移运动

4．2．3 Nodal和FGF信号通路可能通过抑制母源Vsx1的作用而启动ntl在胚环中的表达

4．2．4 Vsx1结合位点的序列和结构特点

4．3 进一步的研究的设想

参考文献

作者简历