桃种质资源群体遗传分析及果实数字基因表达谱构建

摘要

桃（Prunus persica[L.] Batsch）是蔷薇科李属重要的核果类果树，因果实口感好，营养物质丰富，深受消费者喜欢。过去20年，通过传统育种方法国内外已经选出2000多个优良品种，但大多来源于少数亲本材料，遗传背景狭窄，使桃遗传多样性没有随品种资源数量的增加而增加，不利于一些优良性状的改良。国内外应用分子标记已经对桃遗传多样性进行了大量研究，但不同研究组所选标记、植物材料及分析方法不同，难以进行数据整合，所得结果主要适用于所测样本，缺乏一个全景式品种群体分析图。作为桃的原产国，我国拥有4000多年的栽培历史及丰富多样的种质资源，如何选择优良性状亲本，对桃育种进程具有重要意义。为此，本研究采用ABI3130分析系统及48个高多态性SSR标记对我国的434份桃种质资源进行基因分型，并结合前期西班牙研究组用相同标记、相同方法下所得到的224份欧美桃种质资源基因型数据，对世界范围桃种质资源进行遗传对比分析，明确世界范围内桃品种资源的遗传多样性、品种群结构、连锁不平衡程度和在连锁群上分布。选择出中国核心桃种质资源材料采用新型高密度SNP芯片检测遗传变异，并进行简单性状的全基因组关联分析。 桃果实品质研究方面，果实香气及硬度是评价果实品质的重要指标，两者均是由多基因控制的复杂性状，前人采用候选基因克隆、EST文库及微阵列芯片在香气、质地基因功能研究中取得了很大进展，但受基因数量有限，其分子调控机理仍不明确。本研究采用高通量Illumina RNA-seq技术，对‘湖景蜜露’、‘玉露’、‘锦绣黄桃’和‘中华寿桃’4个优良桃栽培品种及‘湖景蜜露’的三个成熟期进行数字基因表达谱构建，从转录组水平全面系统地分析了果实香气物质合成及果实软化的分子调控机理。主要结果如下: 1.653份桃种质资源的遗传多样性分析 48个SSR位点在653份桃种质资源中共扩增得到588个等位基因，平均每位点扩增得到12.25个等位基因，观察杂合度(Ho)则从0.13(PMS02)到0.63(UDP96-005)，平均0.47。东亚桃亚组的遗传多样性显著高于欧美桃亚组，引进东亚品种的可以提高欧美品种的遗传多样性水平。聚类分析可将658份材料按地理起源、驯化进程和果实性状显著区分:野生近缘种与普通桃显著分开;古老地方品种与栽培种显著分开，东亚桃和欧美桃品种群可显著分开;欧美桃和油桃显著分开，选出281份中国桃种质资源用于高密度SNP芯片构建。不同群体LD分析发现东亚品种群LD遗传衰减距离(3.36 cM)比欧美品种群(5.50 cM)小，东亚品种群在应用高密度SNP全基因组关联分析中有更大的优势。‘玉露’亚群的LD水平最高，地方品种群LD水平最低。东亚品种群、欧美品种群及地方品种群在第1、第4连锁群的LD位点组合比例较高，重要的果肉色泽和果肉质地、香气分别位于这两的连锁群上。 2.桃品种特异性荧光SSR分子标记数据库建立及应用 从全基因组范围的48个荧光SSR分子标记中选出15个高多态性标记，经不同荧光标识，最终分为3组在ABI3130测序仪测试。目前数据库包含669份材料。445个中国桃品种中有426(96.6％)个具有特异基因型组合，研究初步建立了159份中国桃核心种质资源分子标记数据库，并提出8个中国品系用作今后资源评价的参照。对17个桃品种进行系谱验证发现，我国资源圃所育成的7个品种系谱信息正确，但日本桃品种系谱信息与文献出现偏差。 3.基于9K高密度SNP芯片的全基因组关联分析 对281份中国桃种质资源进行9K SNP芯片构建，共得到3781个多态性SNP，最小等位基因频率均大于0.03，并选出159个中国桃核心种质资源用于资源保存、管理及全基因组关联分析。邻接法聚类结果显示:3781个SNP与48个SSR聚类结果一致，且与群体结构分析结果一致。叶腺、花型、果肉颜色、果实质地、果皮茸毛、粘离核及果形7个质量性状进行关联分析，Scaffold5上的SNP_IGA_544512标记与叶腺性状呈显著相关性，Scaffold1上的SNP_IGA_103771和Scaffold6上的SNP_IGA_686125与花形呈显著相关，Scaffold1上的SNP_IGA_93479和SNP_IGA_93768与果肉颜色显著相关，Scaffold4上的SNP_IGA_477941、SNP_IGA_477945、SNP_IGA_477951与果肉溶质/不溶质呈显著相关，Scaffold5上的SNP_IGA_596063与果皮茸毛显著相关，Scaffold6和Scaffold1上的SNP_IGA_610889和SNP_IGA_124466与果实粘离核显著相关，Scaffold6上的SNP_IGA_698099、SNP_IGA_697021和SNP_IGA_697026与果形显著相关。 4.应用数字基因表达谱挖掘桃果实香气物质合成及果实质地相关基因 12个数字基因表达谱经过滤共产生89881875测序序列，平均序列长度100bp，78.5％的测序片段比对到了桃参考基因组上。对15个果实香气、软化相关基因进行Q-PCR表达水平验证，结果与RNA-seq所测结果呈现出显著相关性。等级聚类分析将‘湖景蜜露’果实成熟过程中4431个差异表达基因分为24个组，将不同品种间5541个差异表达基因分为14组。‘湖景蜜露’果实成熟过程中，与内酯类物质合成相关的脂质转移酶基因（LTP）、酰基辅酶A氧化酶基因（AC1）及环氧化物水解酶基因（EPH）表达水平变化显著，其中LTP表达水平为先升高后降低趋势，而ACX2对C18脂肪酸具底物特异性，推断与γ-十内酯合成相关。不同品种和不同成熟期的差异表达基因在黄酮类物质合成途径中的富集程度在所有KEGG代谢途径中最高。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语表

1 绪论

1．1 基因组学研究

1．1．1 遗传图谱构建

1．1．2 物理图谱构建及应用

1．1．3 全基因组序列测定

1．1．4 重要性状基因的定位

1．1．5 转录组文库构建

1．1．6 分子标记在桃资源评价方面的应用

1．1．7 分子标记辅助选择育种(MAS)

1．2 全基因组关联分析

1．2．1 连锁不平衡的原理及方法

1．2．2 关联分析的方法及应用

1．2．3 全基因组关联分析在桃树上的应用前景

1．3 桃种质资源概况

1．3．1 我国桃种质资源地理分布及多样性

1．3．2 日本桃种质资源

1．3．3 西班牙桃品种资源

1．3．4 意大利桃育种项目

1．4 SNP分子标记技术的发展及分型方法

1．4．1 单核甘酸多态性SNP的概念

1．4．2 SNP分型方法

1．4．3 数字基因表达谱

2 桃种质资源遗传多样性、群体结构及连锁不平衡分析

2．1 材料和方法

2．1．1 植物材料和模板DNA提取

2．1．2 引物来源

2．1．3 PCR反应体系和程序

2．2 数据分析

2．2．1 遗传多样性和聚类分析

2．2．2 群体结构

2．2．3 连锁不平衡分析

2．3 结果

2．3．1 SSR标记的遗传多样性

2．3．2 聚类分析

2．3．3 群体结构分析

2．3．4 连锁不平衡

2．4 讨论

2．4．1 SSR多态性及种质资源遗传多样性

2．4．2 聚类分析

2．4．3 群体结构

2．4．4 连锁不平衡分析

2．5 小结

3 桃品种特异性荧光SSR分子标记数据库建立及应用

3．1 材料与方法

3．1．1 植物材料

3．1．2 DNA提取

3．1．3 引物选择及PCR扩增

3．1．4 数据分析

3．2 结果

3．2．1 15个标记的多态信息含量分析

3．2．2 指纹图谱构建

3．3 荧光分子标记数据库的应用

3．3．1 品种鉴定中的应用

3．3．2 系谱鉴定中的应用

3．4 讨论

3．4．1 数据准确性

3．4．2 15对SSR标记的遗传多样性及鉴定能力评价

3．5 结论

4 高密度SNP芯片在桃群体结构及性状关联分析中的应用

4．1 材料与方法

4．1．1 植物材料及性状统计

4．1．2 桃基因组DNA提取

4．1．3 SNP芯片构建

4．1．4 数据分析

4．2 结果

4．2．1 SNP基因分型结果

4．2．2 聚类分析及群体结构分析

4．2．3 关联分析

4．3 讨论

4．4 小结

5 不同成熟期与不同桃品种果实表达谱构建

5．1 植物材料及方法

5．1．1 植物材料

5．1．2 香气成分的测定方法

5．1．3 总RNA提取及cDNA合成

5．1．4 引物设计及qRT-PCR验证

5．1．5 数字表达谱的构建

5．2 结果

5．2．1 DGE测序数据质量评估及参考基因组比对分析

5．2．2 基因表达水平分析

5．2．3 差异表达基因Gene Ontology及KEGG富集分析

5．2．4 ‘湖景蜜露’不同成熟期DEGs分析

5．2．5 不同桃品种间差异表达基因分析

5．2．6 qRT-PCR验证RNA-seq结果

5．2．7 差异表达基因的聚类分析

5．2．8 桃成熟过程及不同品种桃香气成分的测定

5．3 讨论

5．3．1 基于RNA-seq的数字基因表达谱的构建

5．3．2 与内酯类物质合成相关的差异表达基因

5．3．3 与果实软化相关的差异表达基因

5．4 小结

6 小结与展望

附表

参考文献

作者简历及在学期间取得的科研成果