负载siRNA真皮替代物的构建及其诱导皮肤无瘢痕修复的研究

摘要

在再生医学领域中，用于组织修复再生的支架材料不仅为细胞长入和组织新生提供模板及空间，而且通过自身携带的化学、物理及生物学信号来指导细胞行为、诱导有利于组织修复的生理过程。小干扰RNA(siRNA)技术是近10年发展起来的一种先进基因技术，它可在“转录后水平”抑制靶基因的表达，即具有RNA干扰(RNA interference，RNAi)效应;将siRNA作为一种生物学信号与再生医学材料相结合的思想是目前的研究前沿和热点。基于再生医学原理的各类皮肤替代物虽然取得了重大进展，然而依然存在瘢痕化等问题，难以在结构和功能上实现皮肤的完全修复即再生性修复。受胎儿皮肤无瘢痕修复现象的启发，已有研究发现:抑制皮肤修复过程中的转化生长因子-β1(TGF-β1)表达水平可减少瘢痕的形成。本文的核心思想是将siRNA技术与三维支架皮肤替代物结合，赋予材料抑制创面TGF-β1表达水平的特性，获得具有诱导皮肤无瘢痕修复性能的再生医学材料。 siRNA高效发挥效用极大程度依赖于siRNA传递载体的选择和设计。为构建负载siRNA的支架材料并有效应用，本文首先研究一种siRNA载体材料——季铵化壳聚糖(TMC)。成功合成了季铵化程度为40％的TMC，TMC可通过静电相互作用与siRNA络合为纳米粒子。透射电镜下观察大多数粒子尺寸小于100nm。N/P比为10时TMC/siRNA粒子粒径最小;孵化时间的延长及孵化温度的提高都导致粒子粒径增大。粒子的ζ电位和siRNA结合率随着N/P升高而增大，至N/P比10之后趋于平稳（分别为+20 mV和90％）。N/P为10及20的粒子在血清中可以有效保护siRNA分别达12h及48 h。当粒子N/P比高于5时，人胚肾293(HEK293)细胞可对TMC/siRNA粒子有效吞噬;粒子胞吞后24 h内从溶酶体逃逸，并分布在细胞质中。以绿色荧光蛋白为目标基因，当粒子N/P比为10～20时，可在HEK293细胞中下调绿色荧光蛋白表达至40％，与商业化载体效率相当;这种基因沉默效应是特异性的，且具有siRNA剂量依赖性。该模型研究表明，TMC是一类有效的siRNA载体材料。 选取N/P为20的TMC/siRNA复合粒子用于后续研究。进一步在二维培养条件下验证TMC/siRNA复合粒子对皮肤无瘢痕修复研究中所涉及的目标细胞（真皮成纤维细胞）和目标基因(TGF-β1)的适用性。进而将TMC/siRNA复合粒子通过物理吸附作用负载到胶原-壳聚糖/硅胶模双层真皮替代物(Bilayerdermal equivament，BDE)中，成功构建RNAi-BDE。胶原-壳聚糖支架对复合粒子具有储存和缓释作用，从而有利于siRNA在组织修复可能较长的时间尺度内持续发挥效用。三维静态培养模型中，人真皮成纤维细胞(Human dermal fibroblast，HDF)在RNAi-BDE内部生长良好，并可有效吞噬TMC/siRNA复合粒子;通过和裸siRNA组对照，再次证实TMC对siRNA的保护和胞吞促进作用。同样的培养模型中，HDF中TGF-β1和Ⅰ型胶原(ColⅠ)的表达在14d内被持续抑制。该结果可归因于支架对siRNA的储存作用;我们认为:随着细胞的不断侵入支架以及支架降解，储存的siRNA逐渐得以接触细胞并发挥效用。 至此，RNAi-BDE对瘢痕化因子的抑制作用已在体外模型得到研究和证明。进一步将RNAi-BDE应用于猪背部全层皮肤创伤的体内模型。第9d、18d和30d的大体观察和组织学分析结果表明，空白BDE和RNAi-BDE均能正常诱导创面血管化及肉芽组织形成，但RNAi-BDE创面不如空白BDE创面细胞外基质沉积多。免疫组化、实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)及蛋白质印迹(WesternBlotting)分析结果表明，RNAi-BDE创面相比空白BDE创面各瘢痕化因子的水平均更低。BDE移植73d后（第14d植皮）的组织样品进行观察和分析，结果表明RNAi-BDE创面相比空白BDE创面的瘢痕化得到显著抑制、所修复的皮肤组织和正常组织极为接近。 为优化负载siRNA的三维支架体系，本文也着眼于通过细胞微环境来调控siRNA传递效率。成功构建了经不同浓度戊二醛(Glutaraldehyde，GA)交联处理的胶原平面膜。随着GA交联浓度提高，胶原膜表面的平整度增加，纤维结构堆积更紧密。无论干态还是湿态下，胶原膜杨氏模量均随着GA浓度提高而显著增加。随着GA浓度提高，胶原膜上6h时细胞粘附数量和细胞铺展面积均增大，细胞形态更铺展、细胞质内肌动蛋白纤维含量更多，细胞增殖较快。以聚乙烯亚胺(Polyethylene imine，PEI)/siRNA复合粒子考察胞吞及基因沉默性能。GA交联浓度更高的胶原膜上细胞对PEI/siRNA粒子的胞吞数量更多、速率更快。所有膜上细胞对粒子胞吞都主要通过巨胞饮途径，且细胞骨架对胞吞过程起到重要作用。GA交联浓度越高的胶原膜上细胞胞吞受细胞骨架影响越显著。随着GA处理浓度的提高，胶原膜上细胞的GAPDH基因沉默效率逐渐提高。该二维平面模型的研究将为如何通过支架本身物理化学性能的设计来调控siRNA的三维传递效率提供有益的借鉴。

目录

声明

致谢

摘要

1 引言(绪论)

1．1 再生医学和组织工程

1．1．1 概述

1．1．2 再生医学支架材料的设计

1．1．3 生物活性信号

1．2 皮肤再生与皮肤替代物

1．2．1 皮肤及其缺损

1．2．2 人工皮肤替代物的设计

1．2．3 人工皮肤替代物的研究进展

1．3 皮肤创面修复与瘢痕化

1．3．1 创面修复的基本过程

1．3．2 瘢痕化的机理及瘢痕抑制

1．3．3 基于TGF-β通路抑制瘢痕

1．4 RNA干扰(RNAi)和小干扰RNA(siRNA)

1．4．1 RNAi现象与机理

1．4．2 siRNA及其载体

1．4．3 负载siRNA的再生医学支架材料

1．4．4 细胞微环境调控RNAi效率

1．5 课题提出

2 季铵化壳聚糖作为siRNA载体的研究

2．1 实验部分

2．1．1 主要原料与试剂

2．1．2 N，N，N三甲基壳聚糖氯化物(TMC)的制备

2．1．3 TMC／siRNA复合粒子的制备

2．1．4 TMC／siRNA复合粒子的粒径和ξ电位

2．1．5 TMC对siRNA的结合能力

2．1．6 TMC对siRNA的保护能力

2．1．7 HEK293细胞培养

2．1．8 TMC／siRNA复合粒子的细胞吞噬

2．1．9 TMC／siRNA复合粒子的细胞内分布

2．1．10 TMC／siRNA复合粒子的基因沉默

2．1．11 TMC／siRNA复合粒子的细胞毒性

2．1．12 统计分析

2．2 TMC／siRNA复合粒子的制备及理化性能表征

2．3 TMC／siRNA复合粒子的稳定性

2．4 TMC／siRNA复合粒子的胞吞性能

2．5 TMC／siRNA复合粒子的基因沉默性能

2．6 本章小结

3 负载siRNA真皮替代物的构建及体外评价

3．1 实验部分

3．1．1 主要原料与试剂

3．1．2 TMC／siRNA复合粒子与HDF二维培养的生物学功能

3．1．3 BDE的制备

3．1．4 TMC／siRNA复合粒子在BDE的负载

3．1．5 TMC／siRNA复合粒子从BDE中的释放

3．1．6 负载TMC／siRNA复合粒子BDE的细胞相容性

3．1．7 BDE中HDF对TMC／siRNA的吞噬性能

3．1．8 BDE中HDF的基因沉默

3．2 二维培养条件TMC／siRNA粒子的生物学性能

3．3 TMC／siRNA粒子在BDE的负载及释放

3．4 HDF在负载TMC／siRNA粒子BDE中的生长与胞吞

3．5 负载TMC／siRNA粒子BDE的基因沉默

3．6 本章小结

4 负载siRNA真皮替代物诱导皮肤无瘢痕修复的体内研究

4．1 实验部分

4．1．1 主要原料与试剂

4．1．2 BDE的制备

4．1．3 动物实验模型

4．1．4 组织学观察

4．1．5 RT-qPCR测试

4．1．6 Western Blotting测试

4．2 动物模型的建立

4．3 短期创面的修复情况

4．4 短期创面的瘢痕因子定量分析

4．5 长期创面的瘢痕抑制

4．6 本章小结

5 胶原基底性质对siRNA传递的调控

5．1 实验部分

5．1．1 主要原料与试剂

5．1．2 GA交联胶原膜的制备

5．1．3 胶原膜的理化性能表征

5．1．4 胶原膜上细胞的粘附与生长

5．1．5 胶原膜上细胞对PEI／siRNA复合粒子的吞噬

5．1．6 胶原膜上细胞的基因沉默

5．1．7 统计分析

5．2 胶原膜的制备和理化性质

5．3 胶原膜上细胞的粘附与生长

5．4 胶原膜上细胞对PEI／siRNA复合粒子的胞吞

5．5 胶原膜上细胞的基因沉默

5．6 本章小结

全文结论

建议与展望

参考文献

作者简介