榨菜与紫甘蓝嫁接嵌合体后代叶形变异产生的分子机理及新种质的创制

摘要

本论文是在榨菜(Brassicajuncea(L.) Czem.et Coss.var.tumida Tsen et Lee)与紫甘蓝(B.oleraceaL.var.capitata L.)嫁接嵌合体后代产生叶形遗传变异的基础上，开展的变异产生的分子机理及种质创新的研究。利用RNA-Seq技术，筛选叶形变异相关候选基因，明确嫁接对基因表达改变的影响;通过MSAP多态性分析及sRNA测序，分析变异后代中DNA甲基化、sRNA的变化，探讨表观修饰在嫁接诱导的遗传变异产生中的作用。同时，利用榨菜与紫甘蓝种间杂交，创制种间异源六倍体。本研究所取得的主要结果如下: (1)通过原位杂交技术，对茎尖分生组织（shoot apical meristem，SAM）细胞层组成进行鉴定，确定嵌合体的类型。以通过叶片解剖结构鉴定的嵌合体TCC（SAM三层细胞层:L1-L2-L3，T代表L1来源于榨菜，C代表L2、L3来源于紫甘蓝）为材料，利用不同类型的特异探针进行原位杂交。当黑芥基因组DNA作为探针与其顶端分生组织杂交时，只有L1层出现杂交信号，而特异atpA基因探针与其顶端分生组织杂交时，在L2、L3层观察到杂交信号。结果表明通过叶片结构鉴定与分子鉴定嵌合体的类型结果相一致，证明通过原位杂交技术鉴定嵌合体类型是可行的。 (2)利用嵌合体TTC自交获得GS1，以此多代自交已得到第五代种子(GS5);通过嵌合体TCC诱导茎段不定芽获得回复榨菜亲本rTTT，其通过有性自交获得第二代材料(RS2)。两类嵌合体通过有性或无性方式获得的后代性状相似，并且叶形变异能够稳定遗传。结果表明通过嫁接嵌合体产生的性状遗传变异材料为种质资源的改良开辟了新的途径。 (3)以嵌合体TTC自交第三代GS3为研究材料，榨菜作为对照，进行了转录组及表达谱研究。通过测序组装得到榨菜63，973条Unigene，通过功能注释分析其参与的途径;此外，与榨菜相比较，GS3有1187条基因显著性差异表达，其中676个基因上调表达，511个基因下调表达，这些差异基因参与众多的生物学过程。其中筛选到了2个与叶形相关的候选基因（ARP、CKO）。结果表明，叶形变异性状的产生与基因表达改变具有相关性。 (4)以嵌合体TTC与TCC变异后代植株(GS1、GS2、GS3、RS1)及榨菜为材料，通过MSAP技术研究变异植株与榨菜对照的DNA甲基化水平及模式。结果表明与榨菜相比，变异后代DNA甲基化水平下降且模式也发生了改变;筛选了能够在变异后代中稳定存在且与榨菜不同的DNA甲基化模式条带，得到了一个发生DNA超甲基化的基因（Gibberellin-regulated family protein）可能与叶形发育的相关。结果表明DNA甲基化的改变可能是诱导嫁接遗传变异产生的重要原因之一。 (5)以rTTT与榨菜为实验材料，通过sRNA测序，研究嫁接对sRNA的影响。研究发现，嫁接改变了植物miRNA的表达水平，与榨菜相比较，有26个miRNAs在rTTT中显著性差异表达，其中包括与叶形相关的miRNA156，miRNA319、miRNA172;对差异表达miRNA的靶基因进行定量分析，其变化趋势符合miRNA表达量的变化。此外还观察到一些参与其它代谢途径及胁迫响应的差异miRNA。结果表明，嫁接会对miRNA的表达产生影响，从而调控植物的生长发育。 (6)通过榨菜和紫甘蓝的种间杂交，获得三倍体杂种及种间异源六倍体新材料。本实验通过对不同授粉后天数的幼胚进行培养，获得了杂种后代，对授粉后14天的胚珠培养效果最好，获得的种子拯救率达到6.67％;通过流式倍性分析、RAPD分子标记及形态观察，得到了一株三倍体真杂种;通过液体培养基添加秋水仙素对茎段外植体进行加倍处理，获得异源六倍体植株，与亲本相比较，异源六倍体表现出特有的性状。

目录

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论文说明

致谢

缩略词表

摘要

1 绪论

1．1 植物嫁接

1．2 嵌合体的研究进展

1．3 嫁接诱导的植物变异的研究进展

1．4 嫁接变异机理的研究进展

1．4．1 砧穗之间遗传物质的水平转移

1．4．2 嫁接环境诱导的遗传变异

1．5 植物small RNA的研究进展

1．5．1 miRNA的研究进展

1．5．2 siRNA的研究进展

1．6 DNA甲基化的研究进展

1．6．1 DNA甲基化的机制

1．6．2 DNA甲基化的生物学功能

1．6．3 植物RNA介导的DNA甲基化

1．7 本研究的目的与意义

2 嵌合体类型的分子鉴定及性状变异后代的获得

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 结果与分析

2．3．1 原位杂交结果

2．3．2 嵌合体后代的获得及性状观察

2．4 讨论

3 榨菜与嫁接变异植株叶形差异基因筛选

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 结果与分析

3．3．1 Total RNA的提取

3．3．2 转录组组装

3．3．3 榨菜转录组功能注释及分类

3．3．4 数字表达谱测序的质量和产量

3．3．5 测序饱和度分析

3．3．6 拷贝数分布统计

3．3．7 基因表达注释

3．3．8 差异表达基因变化模式及功能分析

3．3．9 差异表达基因的qRT-PCR验证分析

3．3．10 候选差异基因qRT-PCR分析

3．4 讨论

4 DNA甲基化在嫁接诱导变异产生中的作用

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验方法

4．3 结果与分析

4．3．1 基因组DNA的提取

4．3．2 预扩增、选择性扩增产物检测

4．3．3 选择性扩增结果

4．3．4 利用MSAP分析榨菜对照与变异后代的DNA甲基化水平

4．3．5 榨菜与变异植株DNA甲基化模式变化分析

4．3．6 甲基化变异条带的序列分析

4．4 讨论

5 miRNA在嫁接变异性状产生中的作用机制

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验方法

5．3 结果与分析

5．3．1 RNA质量检测

5．3．2 测序序列质量分析

5．3．3 榨菜亲本与变异植株保守miRNA分析鉴定

5．3．4 miRNA靶基因预测

5．3．5 miRNA的茎环qRT-PCR分析

5．3．6 榨菜与嫁接变异后代miRNA差异表达研究

5．3．7 靶基因qRT-PCR分析

5．4 讨论

6 榨菜与紫甘蓝异源六倍体的合成及其鉴定

6．1 引言

6．2 材料与方法

6．2．1 实验材料

6．2．2 实验方法

6．3 结果与分析

6．3．1 远缘杂种的获得

6．3．2 榨菜与紫甘蓝杂种鉴定

6．3．3 染色体加倍

6．3．4 榨菜与紫甘蓝杂种后代的形态学观察

6．4 讨论

7 结论、创新点与后续展望

7．1 结论

7．2 创新点

7．3 后续展望

参考文献

发表论文情况