环境钙离子浓度影响三角帆蚌珍珠质形成的生物矿化机理研究

摘要

Cd2+作为主要的环境限制因子之一，显著影响贝类的生长和珍珠的品质。然而，环境Ca2+如何影响贝类珍珠质沉积的分子机制目前仍不清楚。本研究以我国最主要的淡水育珠蚌——三角帆蚌（Hypriosis cumingii）为材料，以Ca2+浓度为关键调控因子，通过测定不同Ca2+浓度下珍珠质沉积量、珍珠质晶体形态、组织酶活性等指标，筛选出适宜三角帆蚌珍珠质沉积的水体Ca2+浓度，为养殖业提供基础数据;通过数字基因表达谱分析(RNA-Seq)，筛选出参与珍珠质形成的主要矿化相关基因，确定Ca2+浓度影响珍珠质沉积的主要代谢和信号转导途径，从而阐明Ca2+影响三角帆蚌珍珠质沉积的分子机理，也为贝类生物矿化机制提供新的研究思路。
　　1、采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了三角帆蚌钙代谢关键的调控因子钙调蛋白(CaM)及其类似蛋白（CaLP）基因的cDNA全长序列，序列长度分别为726 bp和1217bp。组织特异性表达分析表明CaM mRNA主要在鳃、外套膜中央膜和腹足中表达，而CaLP mRNA主要在外套膜缘膜突起中表达。Ca2+迁移电泳结果表明，重组CaLP蛋白比重组CaM蛋白具有更高的Ca2+亲合力。Ca2+刺激实验结果表明，CaM和CaLP在不同Ca2+浓度下(0.25-1.25 mM)具有不同的表达模式，CaM mRNA在Ca2+低浓度(0.25 mM)时表达量最高，而CaLP mRNA在1.0 mM Ca2+浓度时表达量最高。
　　2、采用RACE技术克隆了三角帆蚌中重要的矿化相关基因α-碳酸苷酶（HcCA）cDNA的全长序列，长度为1911 bp，编码550个氨基酸。时空表达分析表明，HcCA mRNA主要在幼蚌的外套膜中表达。空气干露、低温和低pH处理实验结果表明，HcCA mRNA的表达受到上述环境因子的影响，提示其可能在体内酸碱平衡中发挥了重要作用。
　　3、不同Ca2+浓度下三角帆蚌养殖实验结果表明，1龄三角帆蚌在Ca2+浓度在1.0 mM时生长最快，2龄未植片三角帆蚌在Ca2+浓度1.0-1.75 mM时生长性状和珍珠质沉积上优于其它Ca2+浓度，2龄植片三角帆蚌在Ca2+浓度1.0 mM时珍珠沉积量最大。珍珠质小片拉曼光谱和扫描电镜观察结果表明，1.5 mM Ca2+浓度处理组珍珠质小片中有机质的含量高于其它处理组小片的含量。鳃和外套膜组织中碱性磷酸酶(AKP)、Ca-ATP酶、Mg-ATP酶活性测定结果表明，Ca2+浓度在1.0 mM-1.75 mM时有利于三角帆蚌Ca2+的吸收和蓄积。因此，1.0-1.75mM Ca2+浓度为2龄三角帆蚌生长和珍珠质沉积适宜的水体Ca2+浓度。
　　4、采用Illumina HiSeqTM2000平台对外套膜边缘膜组织进行转录组从头测序（RNA-Seq），获得约50M高质量reads，组装成61，119个平均长度为450 bp的Unigene作为参考基因组。Unigene在NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO数据库中共有15，655个获得注释。其中6，322个被注释到生物学过程、分子功能和细胞组分GO类别的55个功能组，11，670个Unigene匹配到25类COG功能组，6，322个Unigene被富集到257条KEGG代谢途径。分析发现三角帆蚌贝壳基质蛋白Unigene37个，生物矿化相关基因Unigene55个，钙代谢相关基因Unigene94个。
　　5、采用RNA-Seq技术对0.25 mM、1.5 mM和2.0 mM Ca2+浓度处理组2龄三角帆蚌外套膜边缘膜组织进行基因差异表达分析。结果表明，在1.5 mM vs0.25mM比对组中共有1604个DEGs表达上调，1489个DEGs表达下调;在1.5 mMvs2.0 mM比对组中共有762个DEGs表达上调，596个DEGs表达下调;筛选出2个比对组中均差异表达的基质蛋白DEGs4个（Papilin、Shematrin8、Nacreserine protease inhibitor1、Perlucin6），生物矿化相关DEGs13个(Chitin synthase、Carbonic anhydrase、C-type lectin等)，钙代谢相关DEGs5个(Calmodulin-likeprotein、Sarcoplasmic calcium-binding protein、Troponin C等)。KEGG代谢途径显著性富集分析结果表明，1.5 mM vs0.25 mM比对组中有384个DEG被富集到维生素消化和吸收、蛋白消化和吸收、吞噬体、酪氨酸代谢等24个代谢途径;1.5 mM vs2.0 mM比对组中有426个DEG被富集到维生素消化和吸收、吞噬体、细胞粘连、细胞骨架调节等35个代谢途径。结果提示，上述差异表达基因和代谢途径可能是Ca2+影响珍珠质沉积的主要基因和代谢途径，它们在三角帆蚌珍珠质形成过程中发挥着关键的调控作用。

目录

封面

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 贝类生物矿化机制研究进展

1．1．1 贝壳的结构

1．1．2 有机基质

1．2贝类ca2+代谢研究进展

1．3 三角帆蚌生物矿化机制研究进展

1．4 本研究的目的和意义

第二章 三角帆蚌生物矿化相关基因的克隆与功能分析

第一节 三角帆蚌钙调蛋白及其类蛋白基因的克隆与功能分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二节 三角帆蚌碳酸苷酶基因克隆与功能分析

1 实验材料和方法

2 结果

3 讨论

第三章 环境钙离子浓度对三角帆蚌珍珠质沉积的影响

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 手术操作

1．3 养殖实验

1．4 珍珠质和珍珠沉积测定

1．5 拉曼光谱分析

1．6 SEM晶体结构分析

1．7 酶活力的测定

1．8 统计分析

2 结果与分析

2．1 生长性状

2．2 晶体结构特征

2．3 酶活性

3 讨论

第四章 三角帆蚌不同Ca2+浓度处理下外套膜组织表达谱分析

第一节 三角帆蚌外套膜组织转录组分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3讨论

第二节 三角帆蚌不同Ca2+浓度处理下外套膜组织表达谱分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

研究小结、创新点及展望

研究小结

创新点

研究展望

博士期间发表论文

参考文献

附录