由高产木质纤维素酶的海洋微生物组成的双菌种固定化体系的构建及应用

摘要

菌丝球由于具有一定的机械强度、多孔网状、表面光滑均匀的独特结构特征，因此被作为一种新型的生物质载体而备受关注。以菌丝球作为固定化微生物的新型生物质载体，采用混合菌种固定化技术，形成固定化菌丝球，建立多菌种共生的微生态环境，使各种固定化微生物协同发挥作用，极大地扩展了微生物在环境生物技术领域的应用范围。本研究以本实验室筛选获得的两株具有木质纤维素降解能力的海洋真菌为基础，构建了一种新型的双菌种固定化体系---固定化菌丝球，并对该体系在造纸废水处理中的应用进行初探，取得了如下的结果:
　　首先从我国浙江东部沿海海域采集到的样品中初步分离出8株具有纤维素降解活力的真菌，筛选出25株具有木质素降解活力的真菌。经过进一步复筛，分别获得一株能产较高纤维素酶的菌株和一株能产较高漆酶的菌株。经菌落形态鉴定以及rDNA-ITS序列鉴定，能产较高纤维素酶的海洋真菌鉴定为微紫青霉属（Penicilliumjanthinellum），并命名为P1;另一株产较高漆酶的海洋真菌鉴定为内生拟盘多毛孢菌属（Pestalotiopsissp.），并命名为J63。
　　第二，鉴于文献中有关内生拟盘多毛孢菌产漆酶的研究报道很少，因此本文对海洋内生拟盘多毛孢菌J63产漆酶进行了较为全面的发酵性能考察。重点考察了培养基的组成（碳源、氮源的种类，不同铜离子浓度以及铜离子的加入时间、不同盐浓度）、培养条件（温度，起始pH）以及外加诱导剂等对产漆酶的影响。实验结果表明在最优的发酵条件下，可得到漆酶酶活5719.7U/L，要高于许多真菌产漆酶的能力。而且该菌株具有广域耐盐性，因此是一株非常具有竞争力的产漆酶菌株。
　　第三，为了充分利用废弃资源，重点选用了7种农业废弃物（稻草粉、麸皮、水葫芦、甘蔗渣、豆荚粉、玉米芯和柚子皮）为底物进行固体发酵生产漆酶，其中水葫芦更是被称为全球十大害草之一。实验结果表明J63菌株利用农业废弃物生产漆酶的潜力巨大，其中以稻草粉发酵产漆酶的能力最强，其次为水葫芦，实现了环境友好型高效低成本生产漆酶。
　　第四，通过紫外诱变和离子注入诱变对J63菌株进行菌种改造，经过初筛和复筛，得到两株正突变菌株A6和B21，其第5天产酶酶活比出发菌株J63分别提高了38.4％和35.5％。而且，菌株A6在耐热性与耐盐性上都有显著提高，酶活分别为出发菌株J63的5～6倍，这将为菌株A6在未来的实际工业应用中创造非常有利的条件。
　　第五，海洋真菌微紫青霉菌P1在一定的液体培养条件下能够形成具有空间网状结构的菌丝球。本研究以菌丝球为载体，通过包埋固定化方法将海洋真菌内生拟盘多毛孢菌J63孢子进行固定，构建了一种新型双菌种全细胞固定化体系。此体系既具有纤维素降解能力，同时还具有木质素降解能力。通过正交试验设计，得到了最优的固定化条件:P1菌丝球的量为10g（湿重）;J63孢子浓度为2×109个/mL;共固定化时间为2d。
　　第六，考察了固定化菌丝球对造纸废水进行生物处理的影响效果，重点研究了不同浓度外加碳源、不同浓度外加氮源、固定化菌丝球用量、温度和初始pH的影响。实验表明，固定化菌丝球可以非常有效地对造纸废水进行生物处理，在10h的处理时间内，生物降解率达到99％以上。而且，经过6批次的循环处理使用，生物降解率仍高达96.4％。表明固定化菌丝球可以较长时间地维持活性，持续、高效地处理废水。在废水处理的过程中，发现菌丝球出现再生长现象。经过6批次废水处理后的固定化菌丝球直径有3.7mm，是未经废水处理的固定化菌丝球直径的1.6倍。经固定化菌丝球处理过的废水由原本呈深绿色、浑浊不清、含有大量细微的不溶性纤维样物质、有恶臭的水变成了无色、澄清、无异味的水。
　　最后，将固定化茵丝球和P1菌丝球分别应用于处理模拟染料废水的脱色研究。在脱色培养10d后，两者都能有效地对染料进行脱色，固定化菌丝球的脱色率比P1菌丝球的脱色率高出近20％。再一次证明了，这种新型的共固定化体系在实际的工业应用中比单纯的菌丝球生物处理具有更加优越的性能，应用范围更加广泛。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 木质纤维素酶及其应用前景

1．1．1 木质纤维素酶的分类

1．1．2 木质纤维素酶高产菌的筛选及育种

1．1．3 木质纤维素酶的应用前景

1．2 海洋微生物生产的木质纤维素酶

1．3 离子注入诱变育种

1．4 废水的生物处理方法

1．5 固定化微生物技术

1．5．1 固定化微生物技术在能源开发方面的应用

1．5．2 固定化微生物技术在环境保护方面的应用

1．6 菌丝球及其在工业中的应用

1．6．1 菌丝球成球机制的研究

1．6．2 菌丝球在处理工业废水中的应用

1．6．3 以菌丝球作为生物质载体及其在工业中的应用

1．7 本论文的研究思路与主要内容

第二章 产纤维素酶的海洋微生物的选育、鉴定及生长特性

2．1 前言

2．2 实验材料与仪器

2．2．1 试剂

2．2．2 培养基

2．2．3 仪器

2．3 实验方法

2．3．1 样品的采集

2．3．2 产纤维素酶的海洋微生物的分离与筛选

2．3．3 菌株筛选

2．3．4 纤维素酶活测定

2．3．5 菌种成球情况的观察

2．3．6 菌种形态观察

2．3．7 菌株的分子生物学鉴定

2．3．8 海洋微紫青霉菌的生长特性及产酶性能

2．4 结果与讨论

2．4．1 菌种筛选结果

2．4．2 菌株形态结构观察结果

2．4．3 菌株分子生物学鉴定结果

2．4．4 菌株Penicillium janthinellum P1的生长曲线

2．4．5 菌株Penicillium janthinellum P1的产酶性能

2．4．6 各菌株成球情况的观察结果

2．5 本章小结

第三章 产漆酶的海洋微生物的选育、鉴定及生长特性

3．1 前言

3．2 实验材料与仪器

3．2．1 试剂

3．2．2 培养基

3．2．3 仪器

3．3 实验方法

3．3．1 样品的采集

3．3．2 海洋微生物的分离

3．3．3 菌株筛选

3．3．4 木质素降解酶酶活的测定

3．3．5 菌株形态观察

3．3．6 菌株的分子生物学鉴定

3．3．7 盐度对海洋内生拟盘多毛孢菌生长的影响

3．4 结果与讨论

3．4．1 菌种筛选结果

3．4．2 菌株形态结构观察结果

3．4．3 菌株分子生物学鉴定结果

3．4．4 菌株Pestalotiopsis sp．J63在不同盐度下的生长曲线

3．5 本章小结

第四章 海洋内生拟盘多毛孢茵J63产漆酶的发酵性能

4．1 前言

4．2 实验方法与仪器

4．2．1 菌种

4．2．2 培养基

4．2．3 试剂

4．2．4 仪器

4．3 实验方法

4．3．1 菌种培养

4．3．2 碳源对海洋内生拟盘多毛孢菌J63产漆酶的影响

4．3．3 氮源对海洋内生拟盘多毛孢菌J63产漆酶的影响

4．3．4 Cu2+对海洋内生拟盘多毛孢菌J63产漆酶的影响

4．3．5 不同盐浓度对海洋内生拟盘多毛孢菌J63产漆酶的影响

4．3．6 温度对海洋内生拟盘多毛孢菌J63产漆酶的影响

4．3．7 初始pH对海洋内生拟盘多毛孢菌J63产漆酶的影响

4．3．8 诱导剂对海洋内生拟盘多毛孢菌J63产漆酶的影响

4．3．9 J63以不同农业废弃物为底物的固体发酵

4．3．10 J63以碱预处理的废弃物为底物的液体发酵

4．3．11 漆酶酶活测定

4．4 结果与讨论

4．4．1 碳源对海洋内生拟盘多毛孢菌J63产漆酶的影响

4．4．2 氮源对海洋内生拟盘多毛孢菌J63产漆酶的影响

4．4．3 Cu2+对海洋内生拟盘多毛孢茵J63产漆酶的影响

4．4．4 不同盐浓度对海洋内生拟盘多毛孢菌J63产漆酶的影响

4．4．5 温度对海洋内生拟盘多毛孢菌J63产漆酶的影响

4．4．6 初始pH对海洋内生拟盘多毛孢菌J63产漆酶的影响

4．4．7 诱导剂对海洋内生拟盘多毛孢菌J63产漆哮的影响

4．4．8 J63以不同农业废弃物为底物的固体发酵产漆酶情况

4．5本章小结

第五章 离子注入诱变选育高性能的海洋内生拟盘多毛孢菌

5．1 前言

5．2 实验材料与仪器

5．2．1 菌种

5．2．2 培养基

5．2．3 试剂

5．2．4 仪器

5．3 实验方法

5．3．1 紫外诱变

5．3．2 离子注入诱变

5．3．3 正突变菌株的初筛与复筛

5．3．4 突变菌株发酵性能

5．3．5 遗传稳定性分析

5．4 结果与讨论

5．4．1 紫外诱变结果

5．4．2 离子注入诱变

5．4．3 初筛结果

5．4．4 复筛结果

5．4．5 突变菌株的性能

5．5 本章小结

第六章 一种新型的双菌种全细胞固定化体系的构建

6．1 前言

6．2 实验材料和仪器

6．2．1 菌种

6．2．2 培养基

6．2．3 试剂与材料

6．2．4 仪器

6．3 实验方法

6．3．1 P1菌丝球的制备

6．3．2 P1菌丝球的最佳成球条件

6．3．3 固定化菌丝球的制备

6．3．4 正交法优化固定化程序

6．3．5 电镜观察菌丝球结构

6．3．6 生物降解造纸废水中的悬浮杂质

6．4 结果与讨论

6．4．1 P1菌丝球的最佳成球条件

6．4．2 固定化过程的优化

6．4．3 P1菌丝球与固定化菌丝球污水处理效果比较

6．5 本章小结

第七章 新型固定化体系在处理废水中的应用

7．1 前言

7．2 实验材料与仪器

7．2．1 菌种与材料

7．2．2 试剂

7．2．3 培养基

7．2．4 仪器

7．3 实验方法

7．3．1 不同浓度碳源对固定化菌丝球处理废水的影响

7．3．2 不同氮源对固定化菌丝球处理污水的影响

7．3．3 不同菌丝球用量对固定化菌丝球处理污水的影响

7．3．4 不同温度对固定化菌丝球处理污水的影响

7．3．5 不同初始pH对固定化菌丝球处理污水的影响

7．3．6 固定化菌丝球的半连续化处理

7．3．7 生物降解反应

7．3．8 生物脱色反应

7．3．9 分析方法

7．4 结果与讨论

7．4．1 不同碳源浓度对固定化菌丝球处理污水的影响

7．4．2 不同氮源浓度对固定化菌丝球处理污水的影响

7．4．3 不同菌丝球用量对固定化菌丝球处理污水的影响

7．4．4 不同温度对固定化菌丝球处理废水的影响

7．4．5 不同起始pH对固定化菌丝球处理废水的影响

7．4．6 固定化菌丝球的半连续化处理

7．4．7 生物降解反应

7．4．8 降解动力学

7．4．9 生物脱色反应

7．5 本章小结

第八章 总结与展望

8．1 结论

8．2 本文创新点

8．3 展望和建议

参考文献

攻读博士学位期间的研究成果

作者简介