抗CD33单链抗体及免疫毒素scFv-GzB的制备及活性检测

摘要

背景:白血病严重威胁人类的健康。据统计，我国白血病的发病率在各种肿瘤中居第六位。目前针对白血病的治疗仍主要采用骨髓移植和化疗等方法，但存在术后复发、毒副反应等问题。免疫疗法成为继化疗和骨髓移植后治疗白血病的新方法，因其毒副作用低、特异性强等优点而得到广泛应用;在常规化疗和移植过程中联合抗体治疗，也取得了良好的效果。近年来随着抗体人源化技术的进步，抗体药物在肿瘤临床治疗领域取得了突破性进展，并逐渐成为全球生物制药领域的热点。
　　目的:本实验室以构建好的全人源白血病噬菌体抗体库为基础，成功筛选出与白细胞分化抗原CD33胞外区蛋白特异性结合的单链抗体(scFv)。表达与CD33胞外区蛋白结合性高的scFv并检测其相关活性;构建scFv与人颗粒酶B(GzB)融合的免疫毒素scFv-Gz B，并对其进行表达及活性检测;将活性高的单链抗体及免疫毒素成功转入酵母表达体系并大量表达。
　　方法:通过ELISA等方法测定单链抗体与CD33胞外区蛋白的结合力，选取结合力较强的序列分别设计相应引物，用体外PCR方法扩增阳性噬菌体抗体基因（1号，23号，76号），通过引入酶切位点将目的片段重组至表达载体PET30a(+)中，进而转化至E.coli BL21中，表达出单链抗体并检测其活性;同时设计相应引物及Linker将scFv转入实验室已构建并保存的颗粒酶B(PET30a-Gz B)重组载体中，表达免疫毒素并测定其生物学活性。
　　结果:成功构建三株单链抗体及对应的单链免疫毒素表达载体，并在大肠杆菌和甲醇酵母体系中表达、纯化得到活性蛋白。经ELISA及Western Blot验证，所表达三株scFv与CD33均有较强的结合;经体外细胞毒性测定，1号scFv及1号/76号scFv-GzB均对CD33阳性白血病细胞有杀伤作用。
　　结论:成功表达、纯化三株单链抗体及相应的免疫毒素，并对其活性进行了初步研究，为后期进一步的功能分析打下了基础，为CD33阳性白血病的治疗提供了可能。

目录

声明

致谢

摘要

学位论文缩略词表

1 绪论

2 CD33胞外区蛋白表达及兔多抗制备

2．1 前言

2．2 主要实验材料

2．3 实验基本操作

2．4 实验方法

2．5 实验结果

2．6 讨论

3 抗CD33单链抗体的制备及活性检测

3．1 前言

3．2 主要实验材料

3．3 基本操作

3．4 实验操作

3．5 实验结果

3．6 讨论

4 抗CD33免疫毒素的制备及活性检测

4．1 前言

4．2 主要实验材料

4．3 实验操作

4．4 实验结果

4．5 讨论

5 单链抗体及免疫毒素在酵母中的表达

5．1 绪论

5．2 实验材料

5．3 基本操作

5．4 实验操作

5．5 实验结果

5．6 讨论

6 结论

参考文献

综述

作者简历及在学期间所取得的科研成果